• 1. 贵州医科大学临床医学院(贵阳 550004);
  • 2. 贵州医科大学附属医院急诊骨科(贵阳 550004);
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目的 研究烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶 3(nicotinamide mononucleotide adenylyl transferase 3,NMNAT3)调节烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide,NAD+)水平对体外模拟氧化应激状态下兔 BMSCs 线粒体功能及其抗氧化应激能力的影响。方法 取新西兰大白兔股骨及胫骨骨髓,采用密度梯度离心联合贴壁培养法体外分离培养 BMSCs 并传代。取第 3 代细胞经流式细胞仪、多向诱导分化鉴定后,采用增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)标记的 NMNAT3 基因过表达慢病毒(Lv-NMNAT3-EGFP)进行转染(BMSCs/Lv-NMNAT3-EGFP),采用实时荧光定量 PCR(real-time fluorescence quantitative PCR,qRT-PCR)及 Western blot 检测 BMSCs 内 NMNAT3 基因及蛋白表达情况,细胞计数试剂盒 8(cell counting kit 8,CCK-8)方法检测细胞增殖能力;以阴性对照慢病毒转染 BMSCs(BMSCs/Lv-EGFP)以及未转染 BMSCs 作为对照。另采用 H2O2 模拟氧化应激处理兔 BMSCs,根据处理条件分为 4 组:A 组为正常 BMSCs,不加 H2O2 处理;B、C、D 组分别取未转染的 BMSCs、BMSCs/Lv-EGFP 和 BMSCs/Lv-NMNAT3-EGFP,采用 H2O2 模拟氧化应激处理。处理 24 h 后检测 NMNAT3 对氧化应激状态下 BMSCs 线粒体功能的影响 [线粒体膜电位改变、NAD+及三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)水平]、BMSCs 抗氧化应激能力变化 [活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平、丙二醛(malondialdehyde,MDA)及锰超氧化物歧化酶(manganese superoxide dismutase,Mn-SOD)含量、过氧化氢酶(catalase,CAT)活性]、对改善 BMSCs 衰老及凋亡的作用 [衰老相关 β-半乳糖苷酶(senescence associated-β-galactosidase,SA-β-gal)染色及 TUNEL 染色]。结果 经鉴定,体外成功分离培养兔 BMSCs;经慢病毒转染技术获得高表达 NMNAT3 基因的兔 BMSCs 稳定株,细胞内 NMNAT3 基因及蛋白明显提高(P<0.05),细胞增殖趋势与正常 BMSCs 无明显差异。使用 H2O2 处理后,各组线粒体功能均出现损伤、细胞凋亡增加,但 D 组与 B、C 组比较,线粒体功能改善,膜电位明显升高,线粒体 NAD+水平及 ATP 合成增加;抗氧化应激能力增强,细胞内 ROS、MDA 含量减少以及抗氧化酶 Mn-SOD、CAT 活性均增加;SA-β-gal 染色阳性细胞比例及细胞凋亡率明显下降。上述指标差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 NMNAT3 通过增加线粒体内 NAD+水平可有效改善氧化应激状态下兔 BMSCs 线粒体功能,并增强其抗氧化应激能力,提高 BMSCs 在应激条件下的存活。

引用本文: 王涛, 彭吾训, 张飞, 郑应刚, 王贞文, 袁大江. NMNAT3 调节 NAD+ 水平对兔 BMSCs 线粒体功能及其抗氧化应激能力影响的研究. 中国修复重建外科杂志, 2020, 34(5): 621-629. doi: 10.7507/1002-1892.201910037 复制

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