• 1. 桂林医学院附属医院四肢创伤手外科(广西桂林 541000);
  • 2. 桂林医学院(广西桂林 541000);
导出 下载 收藏 扫码 引用

目的 探讨小干扰 RNA(small interfering RNA,siRNA)慢病毒介导沉默 P75 神经生长因子受体(P75 neurotrophin receptor,p75NTR)基因对大鼠 BMSCs 成骨分化的影响。方法 首先设计 3 条慢病毒介导 P75NTR 基因的 siRNA 序列(P75NTR-siRNA-1、2、3)以及阴性对照(negative control,NC)siRNA,分别转染第 3 代 SD 大鼠 BMSCs;倒置显微镜下观察细胞形态变化,进一步实时荧光定量 PCR 及 Western blot 检测细胞 P75NTR 基因及蛋白表达情况,并筛选出沉默效果最佳的 P75NTR-siRNA 进行后续成骨分化实验。取第 3 代 SD 大鼠 BMSCs,随机分为实验组、阴性对照组及空白对照组;其中,阴性对照组及实验组分别采用 NC-siRNA 及筛选的 P75NTR-siRNA 慢病毒载体转染 BMSCs,空白对照组为正常 BMSCs。采用 MTT 法检测转染后细胞增殖;各组细胞经成骨诱导分化培养后,Western blot 检测成骨相关骨钙蛋白(osteocalcin,OCN)及 Runx 相关转录因子 2(Runx related transcription factor 2,Runx2),免疫组织化学染色观察Ⅰ型胶原表达情况,ALP 检测以及茜素红染色观察成骨情况。结果 慢病毒介导 P75NTR 基因转染 BMSCs 后,其 P75NTR mRNA 及蛋白表达量均明显降低(P<0.05),并筛选出沉默效果最佳的 P75NTR-siRNA。P75NTR 基因沉默后,MTT 检测显示实验组细胞增殖较两对照组明显增快(P<0.05)。成骨诱导分化培养后,实验组 OCN 及 Runx2 蛋白相对表达量、Ⅰ 型胶原蛋白表达、ALP 活力均明显高于两对照组,差异有统计学意义(P<0.05);且随成骨诱导时间延长,矿化结节逐渐增多。结论 siRNA 慢病毒沉默 P75NTR 基因可以促进大鼠 BMSCs 成骨分化,为治疗骨缺损提供了新思路。