闫颖 1,2 , 刘锋 3 , 侯晓杰 3 , 万居易 3 , 熊琪 3 , 周锐 4 , 廖斌 3
  • 1. 成都中医药大学临床医学院(成都 610075);
  • 2. 西南医科大学中西医结合学院(四川泸州 646000);
  • 3. 西南医科大学附属医院心脏大血管外科(四川泸州 646000);
  • 4. 西南医科大学心血管医学研究所(四川泸州 646000);
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目的 探讨联合调控 Wnt 和 BMP 信号通路在人源诱导多能干细胞(human induced pluripotent stem cells,hiPSCs)分化为心肌细胞中的作用。方法 复苏 hiPSCs 培养,倒置相差显微镜下观察细胞形态,免疫荧光染色鉴定多能性标记物 OCT3/4、NANOG 和 TRA-1-60 表达;传代培养 hiPSCs,取 35 代以内细胞进行后续实验。待细胞融合接近 100% 时开始分化(记为分化第 0 天),加入 Wnt 通路激活剂 CHIR99021。于分化第 3 天加入不同浓度的 IWP4(Wnt 通路抑制剂),实时荧光定量 PCR 检测心肌细胞特异性标记物肌钙蛋白 T(troponin T,TNNT2)mRNA 表达,筛选 IWP4 最佳浓度;在不同时间点加入最佳浓度 IWP4,通过比较 TNNT2 mRNA 表达筛选最佳作用时间。然后,在加入 CHIR99021 和 IWP4 基础上于分化第 5 天加入不同浓度 BMP-4 以及不同时间点加入 BMP-4,通过检测 TNNT2 mRNA 表达筛选 BMP-4 最佳浓度及最佳作用时间。最后,将 hiPSCs 分为 3 组,Wnt 调控组、BMP 调控组和 Wnt+BMP 联合调控组,在分化第 0 天加入 CHIR99021 基础上,分别按照筛选结果加入 IWP4、BMP-4、IWP4+BMP-4。收集分化第 7、15 天细胞,实时荧光定量 PCR 检测心肌前体细胞标记物 ISL1(ISL LIM homeobox 1)、NKX2-5(NK2 homeobox 5)以及心肌细胞特异性标记肌细胞增强因子 2C(myocyte enhancer factor 2C,MEF2C)、肌球蛋白轻链 2(myosin light chain 2,MYL2)、MYL7 及 TNNT2 mRNA 表达;收集分化第 28 天细胞,流式细胞术及免疫荧光染色检测心肌细胞特异性蛋白心肌肌钙蛋白 T(cardiac troponin T,cTnT)表达。结果 细胞形态及免疫荧光染色观察显示 hiPSCs 表达多能性标记物 OCT3/4、NANOG 和 TRA-1-60,提示其具有良好的多能性特点。IWP4 促 hiPSCs 向心肌细胞分化的最佳浓度为 10.0 μmol/L(P<0.05),最佳作用时间是分化第 3 天(P<0.05)。BMP-4 促 hiPSCs 向心肌细胞分化的最佳浓度为 20.0 ng/mL(P<0.05),最佳作用时间是分化第 3 天(P<0.05)。Wnt+BMP 联合调控组 ISL1、NKX2-5 以及 MEF2C、MYL2、MYL7、TNNT2 mRNA 相对表达量,cTnT 阳性表达率,以及免疫荧光染色 cTnT 阳性表达和肌节结构,均优于 Wnt 调控组,相关定量指标差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 联合调控 Wnt 和 BMP 信号通路可以提高 hiPSCs 诱导分化为心肌细胞的效率。