引用本文： 黄成龙, 赵松, 程飚, 陈刚, 潘界恩. 微骨折技术联合仿生水凝胶支架促进兔肩袖腱-骨愈合的实验研究. 中国修复重建外科杂志, 2020, 34(9): 1177-1183. doi: 10.7507/1002-1892.202001029 复制
随着手术技术和材料的不断进步，肩袖损伤修补术的临床疗效已显著提高，但仍有 13%～43% 患者术后发生再撕裂[1]，分析原因为术后肩袖是通过在腱-骨界面形成瘢痕组织实现愈合，缺乏正常的多层过渡结构，无法有效传递载荷，容易发生再撕裂[2]。为此，国内外学者们希望通过添加生长因子、干细胞以及采用生物材料、生物补片等技术来促进腱-骨愈合[3-4]。研究表明，将生物材料和细胞共培养可以构建正常腱-骨结构[5]，但细胞在体外培养存在污染、活性降低等风险[6]。生长因子等生物活性物质可以诱导和促进细胞生长和分化，有效促进腱-骨愈合，但存在半衰期短、容易降解等不足，而且无法精确调控最佳剂量[7]。生物补片虽然能加强修补肩袖，而且制备工艺也在不断完善，但存在免疫反应导致的排斥反应，失败率仍超过 30%[8]。利用静电纺丝技术制备人工补片具有临床应用潜力，但目前仍处于研究阶段[9-10]。
BMSCs 具有多向分化潜能，是目前研究最多的干细胞之一[8]。微骨折是目前临床上修复软骨损伤的常用方法之一，通过微骨折处理可以招募 BMSCs 进入损伤部位，参与组织修复。有研究应用肩袖止点骨床微骨折技术，使 BMSCs 向止点骨床迁移，促进肌腱纤维的修复和腱-骨愈合[11]。但是，因为缺乏合适的载体，微骨折过程中产生的 BMSCs 会流失到周围组织，所以需要具有合适孔隙的支架材料用于富集干细胞，提高局部干细胞浓度，从而促进组织修复[12-13]。明胶是Ⅰ型胶原变性水解后的蛋白质产物，具有良好的生物降解性和组织相容性，以及成本低、易获得、降解后无毒性等优点，同时还保留了胶原蛋白的细胞黏附特性，能够负载细胞和生物活性物质，是制备组织工程支架的理想材料[14-15]。本实验以明胶为主要原料构建仿生水凝胶支架，用其富集肩袖止点骨床微骨折产生的 BMSCs，观察微骨折技术联合仿生水凝胶支架对兔肩袖腱-骨愈合的影响。报告如下。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要材料、仪器
24 只成年新西兰大白兔，雌雄不限，体质量 2.8～3.5 kg，由上海市松江区松联实验动物场提供。明胶、甲基丙烯酸酐、光引发剂 Irgacure2959（Sigma 公司，美国）；2-0 医用涤纶编织线（上海浦东金环医疗用品股份有限公司）；2 号 Orthocord 缝线（强生公司，美国）；HE 染色试剂盒（南京建成生物工程研究所）。冷冻干燥机（苏州赛恩斯仪器有限公司）；扫描电镜（TESCAN 公司，捷克）；Micro-CT（通用公司，美国）；生物力学测试机（Instron 公司，美国）。
1.2 仿生水凝胶支架的制备及观测
1.2.1 支架制备方法
取 20 g 明胶加入 100 mL PBS 缓冲液，50℃ 恒温水浴中搅拌至溶解；取 16 mL 甲基丙烯酸酐，以 0.5 mL/min 速度滴加至上述溶液，50℃ 恒温摇床中震荡反应 1 h；加入 500 mL PBS 缓冲液，不断搅拌以终止反应。置入透析袋 [透析分子量 （12～14）×103] 中，于去离子水中透析 1 周；将透析后的溶液以离心半径 15 cm，3 000 r/min 离心 10 min；取上清液，置于−20℃ 冰箱中过夜，冷冻干燥机中冷冻干燥，得到甲基丙烯酰胺基明胶（gelatin methacryloyl，GelMA）备用 [15-16]。配置 0.25wt% Irgacure2959 水溶液 10 mL，取冻干后的 GelMA 加入溶液中搅拌溶解，获得浓度为 5wt% 的 GelMA 单体预聚溶液，转移至培养皿中，用波长 320～500 nm、光强 1.44 W/cm2的紫外光照射 2 min，置于−20℃ 冰箱中过夜，冷冻干燥机冷冻干燥后经 60Co 辐照灭菌，获得仿生水凝胶支架。
1.2.2 观测指标
① 大体及微观结构观察：大体观察仿生水凝胶支架颜色、性状后，将其修剪成合适大小，使用碳粉导电胶黏贴于样品托上，喷金处理后，扫描电镜下观察微观形貌。
② 体外降解性能测试：取冻干的仿生水凝胶支架，称量其初始质量（W0）后，浸泡于含有 10 mL PBS 溶液的离心管中，置于 37℃ 恒温水浴摇床中，设置降解时间点为 3、6、9、12、15、18 d，每个时间点放置 6 个样本。取各时间点降解后的仿生水凝胶支架，冻干后再次称重（Wt），计算降解率，公式为（W0-Wt）/W0×100%，观察支架降解情况。
1.3 实验分组及方法
取 24 只新西兰大白兔制作双前肢急性肩袖损伤模型后，肩袖止点骨床行微骨折处理；同一只兔随机在一侧肩袖与止点骨床上植入仿生水凝胶支架（实验组），另一侧不植入支架（对照组）。
具体操作步骤：实验动物经耳缘静脉推注 3% 戊巴比妥钠（1 mL/kg）麻醉后侧卧位固定，沿肱骨大结节外侧作长约 2 cm 正中切口，逐层分离皮下组织；沿三角肌纤维走行方向钝性分离三角肌，向两侧牵开，显露冈上肌肌腱及其止点；在止点处全层切断冈上肌肌腱，用刀片刮除肌腱止点足印区软骨，用直径 0.8 mm 克氏针在骨床上钻 4 个 3 mm 深的孔。实验组：将仿生水凝胶支架修剪成合适大小，覆盖在微骨折处理后的骨床上，使用 2-0 医用涤纶编织线将冈上肌肌腱采用穿骨固定方式固定于止点骨床上，可吸收缝线依次缝合深筋膜、浅筋膜及皮肤，适当加压包扎；对照组不植入支架，按照实验组方法直接缝合肌腱及切口。见图 1。
图1
实验组动物模型制备示意图
a. 急性肩袖损伤；b. 微骨折处理；c. 植入仿生水凝胶支架；d. 穿骨固定缝合肩袖
Figure1. Establishment of the experimental rabbit modela. Acute rotator cuff tear; b. Microfracture on the foot print; c. Implantation of biomimetic hydrogel scaffold; d. Rotator cuff was repaired by transosseous suture
术后即刻以及第 1 天，每只动物肌肉注射 80 万 U 青霉素预防感染；正常饲养，允许自由活动。术后 4、8 周各取 12 只动物，采用空气栓塞法处死。按原切口入路行大体观察后，完整切取冈上肌肌腱-肱骨复合体。其中 6 只标本行生物力学测试，其余 6 只行 Micro-CT 检查及组织学观察。
1.4 观测指标
1.4.1 一般情况
观察两组动物术后存活情况、切口愈合及肢体运动情况。
1.4.2 大体观察
肉眼观察冈上肌萎缩及腱-骨界面愈合情况。
1.4.3 Micro-CT 检测
取标本采用 Micro-CT 评价肌腱止点骨床骨密度（bone mineral density，BMD）及骨发生情况，扫描参数：80 kV、450 mA，在腱-骨界面连接处选取一个直径 6 mm、高 5 mm 的圆柱形区域作为感兴趣区域。测量该区域 BMD、组织骨密度（tissue mineral density，TMD）和骨体积分数（bone volume/total volume，BV/TV）。
1.4.4 组织学观察
标本置于 4% 多聚甲醛溶液固定 24 h 后，置于 0.25 mol/L EDTA 缓冲液中完全脱钙，石蜡包埋；于冈上肌及大结节矢状面平行方向切片，片厚 5 μm，常规 HE 染色。光镜下观察腱-骨愈合情况，并根据 Ide 等[17]的肌腱成熟度评分表，半定量评估肌腱在腱-骨止点处成熟度。
1.4.5 生物力学测定
切除标本肱骨上附着的软组织，只保留冈上肌，剪断大结节外侧固定冈上肌肌腱线结。标本固定于生物力学测试机，骨端用定制夹具固定，肌腱端用 2 号 Orthocord 缝线编织后与载荷单元连接，维持冈上肌-肱骨外展 135°、前屈 165° 位。先加载 5 N 前负荷，使冈上肌肌腱保持适当张力。加载负荷区间为 5～30 N，固定往复位移 1 mm，频率 0.25 Hz，循环牵拉 40 次，对冈上肌肌腱行应力松解。然后以 1 mm/s 速度牵拉冈上肌肌腱至断裂，记录拉断时极限负荷和整个过程中负荷及位移变化，绘制负荷-应力曲线并计算刚度。
1.5 统计学方法
采用 SPSS19.0 统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用配对 t 检验；检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 仿生水凝胶支架观测
仿生水凝胶支架外观呈白色，厚度约 1 mm。扫描电镜观察显示，仿生水凝胶支架具有丰富多孔结构，孔径为 31.7～89.9 μm，平均 60.2 μm。支架置于 PBS 溶液后缓慢降解，9 d 时降解率约为 48%，15 d 时约为 83%，18 d 时约为 95%。见图 2。
图2
仿生水凝胶支架观测
a. 大体观察；b. 扫描电镜观察（×500）；c. 支架降解率
Figure2. Observation of biomimetic hydrogel scaffolda. Gross observation; b. Scanning electron microscope observation (×500); c. Degradation rate of the scaffold
2.2 一般情况
术后动物均存活至实验完成，恢复正常肢体活动。切口愈合良好，无感染发生。
2.3 大体观察
术后 4、8 周，两组标本冈上肌无萎缩，冈上肌肌腱与止点骨床愈合良好，腱-骨连接部界限不明显，未见明显缺损和再撕裂。两组组内 4、8 周观察情况无明显差异。见图 3。
图3
术后各时间点两组大体观察
a. 对照组术后 4 周；b. 实验组术后 4 周；c. 对照组术后 8 周；d. 实验组术后 8 周
Figure3. Gross observation of tendon-to-bone healing in both groups at each time point after operationa. Control group at 4 weeks; b. Experimental group at 4 weeks; c. Control group at 8 weeks; d. Experimental group at 8 weeks
2.4 Micro-CT 检测
术后 4、8 周，两组肌腱止点骨床未见明显差异。见图 4。术后 4、8 周两组 TMD、BMD 和 BV/TV 差异均无统计学意义（P>0.05）；对照组组内术后 4、8 周 BV/TV 差异有统计学意义（t=5.413，P=0.003），两组组内其他指标 4、8 周间比较差异均无统计学意义（P>0.05）。见表 1。
表1
术后各时间点两组 Micro-CT 检测结果（n=6，
）
Table1.
Micro-CT analysis in both groups at each time point after operation (n=6, 
)
图4
术后各时间点两组 Micro-CT 观察
a. 对照组术后 4 周；b. 实验组术后 4 周；c. 对照组术后 8 周；d. 实验组术后 8 周
Figure4. Micro-CT images of both groups at each time point after operationa. Control group at 4 weeks; b. Experimental group at 4 weeks; c. Control group at 8 weeks; d. Experimental group at 8 weeks
2.5 组织学观察
术后 4 周，对照组腱-骨界面以纤维瘢痕为主，界面间无明显间隙，肌腱纤维排列大致正常；实验组腱-骨界面部分区域可见矿化软骨和少量纤维软骨形成，排列紊乱，界面间无明显间隙，无支架残留、炎症反应和肉芽组织形成，肌腱纤维排列大致正常。术后 8 周，对照组腱-骨界面仍以纤维瘢痕为主，局部可见少量软骨，肌腱纤维排列正常；实验组腱-骨界面部分区域可见矿化软骨和纤维软骨有序排列成过渡结构，界面间无明显间隙，肌腱纤维排列正常。见图 5。
图5
术后各时间点两组 HE 染色观察（×100）
B 表示骨组织，I 表示腱-骨界面，T 表示肌腱 a. 对照组术后 4 周；b. 实验组术后4 周；c. 对照组术后 8 周；d. 实验组术后 8 周
Figure5. HE staining of both groups at each time point after operation (×100)B indicated bone, I indicated tendon-to-bone interface, T indicated tendon a. Control group at 4 weeks; b. Experimental group at 4 weeks; c. Control group at 8 weeks; d. Experimental group at 8 weeks
对照组和实验组术后 4 周肌腱成熟度评分分别为（12.5±1.0）、（16.8±0.8）分，术后 8 周分别为（16.2±0.8）、（23.0±1.1）分。术后 4、8 周，实验组肌腱成熟度评分均优于对照组，差异有统计学意义（t=6.500，P=0.001；t=10.448，P=0.000）。 对照组和实验组组内术后 4、8 周肌腱成熟度评分，差异均有统计学意义（t=7.416，P=0.001；t=12.921，P=0.000）。
2.6 生物力学测定
两组标本均于腱-骨界面处拉断。术后 4 周对照组和实验组极限负荷、刚度差异均无统计学意义（P>0.05）；术后 8 周实验组极限负荷明显优于对照组，差异有统计学意义（t=4.162，P=0.009），刚度比较差异无统计学意义（t=2.286，P=0.071）。两组组内术后 8 周极限负荷及刚度均优于 4 周，差异有统计学意义（P<0.05）。见表 2。
表2
术后各时间点两组生物力学测定结果（n=6，
）
Table2.
Biomechanical test in both groups at each time point after operation (n=6, 
)
3 讨论
正常肩袖腱-骨界面由肌腱、纤维软骨、矿化软骨和骨组织四层逐渐过渡结构形成，而肩袖修补术后腱-骨界面的多层过渡结构被瘢痕替代，导致肩袖力学性能减弱，存在再断裂可能。通过组织工程方法改变腱-骨界面愈合方式，重建正常腱-骨止点结构，是提高肩袖修补术疗效的重要研究方向，近年相关研究对于种子细胞及生物材料的选择、支架的设计、生长因子的应用等方面进行了深入探讨[18]。
BMSCs、脂肪干细胞、滑囊干细胞、肌腱干细胞、骨膜干细胞等干细胞具有多向分化潜能，可以促进腱-骨止点的修复。但作为种子细胞，脂肪干细胞存在更新能力差、定向诱导机制仍不明确等不足；滑囊干细胞需要在体外分离和培养，目前仍处于研究早期；肌腱干细胞存在含量少、分离和纯化困难等问题；骨膜干细胞数量较少，限制了其在肩袖修复中的应用[19]。而 BMSCs 是目前研究应用最多的干细胞，具有多向分化特性、分泌生物活性分子、提供再生微环境等优势，是一种具有应用前景的组织工程种子细胞[20]。但目前干细胞技术面临程序耗时、细胞来源缺乏、分化调节不确定、宿主可能发生免疫反应、难以储存和运输等问题，增加了临床转化的难度[21]。为了便于临床应用，需要简便快速的方法来获取 BMSCs。微骨折技术是目前临床上获得 BMSCs 的有效途径之一，可用于关节软骨缺损的修复和促进肩袖腱-骨愈合[11-12]，手术过程中直接在肩袖止点骨床上钻孔，无需通过额外侵袭性手术来获取种子细胞，未明显增加手术创伤和延长手术时间，很好地解决了干细胞来源问题。Kida 等[22]发现在大结节骨床钻孔可以让 BMSCs 从骨髓中渗透，参与肩袖修复，促进肩袖愈合。Bilsel 等[11]通过慢性肩袖损伤动物模型，研究微骨折技术对肩袖愈合的影响。生物力学和组织学观察结果显示，微骨折技术能够促进腱-骨愈合。Milano 等[23]报道了关节镜下肩袖修补术中应用微骨折技术的疗效，对于涉及冈上肌和冈下肌的大肩袖撕裂，微骨折组的治愈率显著提高。Snyder 等[24]认为通过微骨折技术能够在肩袖止点骨床区域形成富含 BMSCs、生长因子和促血管生成因子的纤维蛋白凝块，诱导细胞迁移和增殖，促进腱-骨愈合。
除了干细胞，组织工程支架也是促进腱-骨愈合的有效途径之一。BMSCs 与组织工程支架的联合应用能够更好地修复肩袖损伤[25]。理想的组织工程支架降解速率应与组织形成速率匹配，同时具有适合细胞生长和营养物质交换的三维结构[26-27]。利用冷冻干燥法可以制备具有合适孔径、孔隙相对均匀、连通性好的多孔支架，还能避免支架表面生物活性分子的破坏[26]。本研究选择该方法制备了仿生水凝胶支架，扫描电镜观察显示获得的支架具有丰富的多孔结构，平均孔径为 60.2 μm，这种大小的孔径有利于细胞穿透和骨软骨的形成[28]。体外降解性能测试显示，支架 9 d 时降解率约为 48%，15 d 时约为 83%。而肩袖修补术后愈合过程可以分成炎症反应期（0～7 d）、修复期（5～14 d）和重塑期（>14 d）3 个阶段[29]，结合体外降解实验结果，本研究制备的仿生水凝胶支架降解速率能够满足腱-骨界面修复的需求，不会阻碍腱-骨愈合。
本研究 Micro-CT 检测未发现仿生水凝胶支架对腱-骨界面新骨形成有促进作用，但组织学观察提示术后 4 周实验组腱-骨界面部分区域有少量软骨组织，未见支架残留和炎症反应，进一步说明制备的仿生水凝胶支架降解速率能满足腱-骨界面修复的要求，同时具有良好的组织相容性，而且随着时间的推移，实验组软骨排列更加有序。生物力学测试结果表明，术后 8 周实验组极限负荷明显大于对照组，说明实验组腱-骨结构抗拉性能优于对照组。Dai 等[30]用制备的多孔纤维蛋白支架修复兔软骨缺损，在不添加外源性细胞的前提下，实现了原位软骨修复。Sofu 等[31]运用微骨折技术联合透明质酸支架修复膝关节软骨缺损，结果显示与单纯微骨折处理相比，联合使用透明质酸支架能更好地促进软骨修复，取得更好疗效。本研究结果也表明，与单纯微骨折处理相比，微骨折技术联合仿生水凝胶支架能够更好地促进腱-骨界面多层结构的修复。
综上述，仿生水凝胶支架具有较好的理化性质和组织相容性，与微骨折技术联合使用，可以更好地促进肩袖腱-骨愈合，增强腱-骨界面抗拉性能，有望用于肩袖损伤的再生与修复。但本研究还存在一些不足，如未进行体外细胞实验，未设置假手术组和单纯切断缝合对照组、标本数量偏少，由于动物肩关节解剖结构和运动特点，无法完全模拟人肩袖损伤及愈合过程。另外，由于本研究使用的是急性肩袖损伤模型，仿生水凝胶支架对慢性肩袖损伤的修复作用有待进一步研究。
作者贡献：程飚、赵松负责整体科研设计；黄成龙负责实验实施、数据收集整理、统计分析及文章撰写；陈刚和潘界恩参与实验实施。
利益冲突：所有作者声明，在课题研究和文章撰写过程中不存在利益冲突。项目经费支持没有影响文章观点和对研究数据客观结果的统计分析及其报道。
机构伦理问题：研究方案经嘉兴学院附属第二医院医学伦理委员会批准（jxey-2020SZ048）。实验动物生产许可证号：SCXK（沪）2017-0008，使用许可证号：SYXK（沪）2016-0020。
随着手术技术和材料的不断进步，肩袖损伤修补术的临床疗效已显著提高，但仍有 13%～43% 患者术后发生再撕裂[1]，分析原因为术后肩袖是通过在腱-骨界面形成瘢痕组织实现愈合，缺乏正常的多层过渡结构，无法有效传递载荷，容易发生再撕裂[2]。为此，国内外学者们希望通过添加生长因子、干细胞以及采用生物材料、生物补片等技术来促进腱-骨愈合[3-4]。研究表明，将生物材料和细胞共培养可以构建正常腱-骨结构[5]，但细胞在体外培养存在污染、活性降低等风险[6]。生长因子等生物活性物质可以诱导和促进细胞生长和分化，有效促进腱-骨愈合，但存在半衰期短、容易降解等不足，而且无法精确调控最佳剂量[7]。生物补片虽然能加强修补肩袖，而且制备工艺也在不断完善，但存在免疫反应导致的排斥反应，失败率仍超过 30%[8]。利用静电纺丝技术制备人工补片具有临床应用潜力，但目前仍处于研究阶段[9-10]。
BMSCs 具有多向分化潜能，是目前研究最多的干细胞之一[8]。微骨折是目前临床上修复软骨损伤的常用方法之一，通过微骨折处理可以招募 BMSCs 进入损伤部位，参与组织修复。有研究应用肩袖止点骨床微骨折技术，使 BMSCs 向止点骨床迁移，促进肌腱纤维的修复和腱-骨愈合[11]。但是，因为缺乏合适的载体，微骨折过程中产生的 BMSCs 会流失到周围组织，所以需要具有合适孔隙的支架材料用于富集干细胞，提高局部干细胞浓度，从而促进组织修复[12-13]。明胶是Ⅰ型胶原变性水解后的蛋白质产物，具有良好的生物降解性和组织相容性，以及成本低、易获得、降解后无毒性等优点，同时还保留了胶原蛋白的细胞黏附特性，能够负载细胞和生物活性物质，是制备组织工程支架的理想材料[14-15]。本实验以明胶为主要原料构建仿生水凝胶支架，用其富集肩袖止点骨床微骨折产生的 BMSCs，观察微骨折技术联合仿生水凝胶支架对兔肩袖腱-骨愈合的影响。报告如下。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要材料、仪器
24 只成年新西兰大白兔，雌雄不限，体质量 2.8～3.5 kg，由上海市松江区松联实验动物场提供。明胶、甲基丙烯酸酐、光引发剂 Irgacure2959（Sigma 公司，美国）；2-0 医用涤纶编织线（上海浦东金环医疗用品股份有限公司）；2 号 Orthocord 缝线（强生公司，美国）；HE 染色试剂盒（南京建成生物工程研究所）。冷冻干燥机（苏州赛恩斯仪器有限公司）；扫描电镜（TESCAN 公司，捷克）；Micro-CT（通用公司，美国）；生物力学测试机（Instron 公司，美国）。
1.2 仿生水凝胶支架的制备及观测
1.2.1 支架制备方法
取 20 g 明胶加入 100 mL PBS 缓冲液，50℃ 恒温水浴中搅拌至溶解；取 16 mL 甲基丙烯酸酐，以 0.5 mL/min 速度滴加至上述溶液，50℃ 恒温摇床中震荡反应 1 h；加入 500 mL PBS 缓冲液，不断搅拌以终止反应。置入透析袋 [透析分子量 （12～14）×103] 中，于去离子水中透析 1 周；将透析后的溶液以离心半径 15 cm，3 000 r/min 离心 10 min；取上清液，置于−20℃ 冰箱中过夜，冷冻干燥机中冷冻干燥，得到甲基丙烯酰胺基明胶（gelatin methacryloyl，GelMA）备用 [15-16]。配置 0.25wt% Irgacure2959 水溶液 10 mL，取冻干后的 GelMA 加入溶液中搅拌溶解，获得浓度为 5wt% 的 GelMA 单体预聚溶液，转移至培养皿中，用波长 320～500 nm、光强 1.44 W/cm2的紫外光照射 2 min，置于−20℃ 冰箱中过夜，冷冻干燥机冷冻干燥后经 60Co 辐照灭菌，获得仿生水凝胶支架。
1.2.2 观测指标
① 大体及微观结构观察：大体观察仿生水凝胶支架颜色、性状后，将其修剪成合适大小，使用碳粉导电胶黏贴于样品托上，喷金处理后，扫描电镜下观察微观形貌。
② 体外降解性能测试：取冻干的仿生水凝胶支架，称量其初始质量（W0）后，浸泡于含有 10 mL PBS 溶液的离心管中，置于 37℃ 恒温水浴摇床中，设置降解时间点为 3、6、9、12、15、18 d，每个时间点放置 6 个样本。取各时间点降解后的仿生水凝胶支架，冻干后再次称重（Wt），计算降解率，公式为（W0-Wt）/W0×100%，观察支架降解情况。
1.3 实验分组及方法
取 24 只新西兰大白兔制作双前肢急性肩袖损伤模型后，肩袖止点骨床行微骨折处理；同一只兔随机在一侧肩袖与止点骨床上植入仿生水凝胶支架（实验组），另一侧不植入支架（对照组）。
具体操作步骤：实验动物经耳缘静脉推注 3% 戊巴比妥钠（1 mL/kg）麻醉后侧卧位固定，沿肱骨大结节外侧作长约 2 cm 正中切口，逐层分离皮下组织；沿三角肌纤维走行方向钝性分离三角肌，向两侧牵开，显露冈上肌肌腱及其止点；在止点处全层切断冈上肌肌腱，用刀片刮除肌腱止点足印区软骨，用直径 0.8 mm 克氏针在骨床上钻 4 个 3 mm 深的孔。实验组：将仿生水凝胶支架修剪成合适大小，覆盖在微骨折处理后的骨床上，使用 2-0 医用涤纶编织线将冈上肌肌腱采用穿骨固定方式固定于止点骨床上，可吸收缝线依次缝合深筋膜、浅筋膜及皮肤，适当加压包扎；对照组不植入支架，按照实验组方法直接缝合肌腱及切口。见图 1。
图1
实验组动物模型制备示意图
a. 急性肩袖损伤；b. 微骨折处理；c. 植入仿生水凝胶支架；d. 穿骨固定缝合肩袖
Figure1. Establishment of the experimental rabbit modela. Acute rotator cuff tear; b. Microfracture on the foot print; c. Implantation of biomimetic hydrogel scaffold; d. Rotator cuff was repaired by transosseous suture
术后即刻以及第 1 天，每只动物肌肉注射 80 万 U 青霉素预防感染；正常饲养，允许自由活动。术后 4、8 周各取 12 只动物，采用空气栓塞法处死。按原切口入路行大体观察后，完整切取冈上肌肌腱-肱骨复合体。其中 6 只标本行生物力学测试，其余 6 只行 Micro-CT 检查及组织学观察。
1.4 观测指标
1.4.1 一般情况
观察两组动物术后存活情况、切口愈合及肢体运动情况。
1.4.2 大体观察
肉眼观察冈上肌萎缩及腱-骨界面愈合情况。
1.4.3 Micro-CT 检测
取标本采用 Micro-CT 评价肌腱止点骨床骨密度（bone mineral density，BMD）及骨发生情况，扫描参数：80 kV、450 mA，在腱-骨界面连接处选取一个直径 6 mm、高 5 mm 的圆柱形区域作为感兴趣区域。测量该区域 BMD、组织骨密度（tissue mineral density，TMD）和骨体积分数（bone volume/total volume，BV/TV）。
1.4.4 组织学观察
标本置于 4% 多聚甲醛溶液固定 24 h 后，置于 0.25 mol/L EDTA 缓冲液中完全脱钙，石蜡包埋；于冈上肌及大结节矢状面平行方向切片，片厚 5 μm，常规 HE 染色。光镜下观察腱-骨愈合情况，并根据 Ide 等[17]的肌腱成熟度评分表，半定量评估肌腱在腱-骨止点处成熟度。
1.4.5 生物力学测定
切除标本肱骨上附着的软组织，只保留冈上肌，剪断大结节外侧固定冈上肌肌腱线结。标本固定于生物力学测试机，骨端用定制夹具固定，肌腱端用 2 号 Orthocord 缝线编织后与载荷单元连接，维持冈上肌-肱骨外展 135°、前屈 165° 位。先加载 5 N 前负荷，使冈上肌肌腱保持适当张力。加载负荷区间为 5～30 N，固定往复位移 1 mm，频率 0.25 Hz，循环牵拉 40 次，对冈上肌肌腱行应力松解。然后以 1 mm/s 速度牵拉冈上肌肌腱至断裂，记录拉断时极限负荷和整个过程中负荷及位移变化，绘制负荷-应力曲线并计算刚度。
1.5 统计学方法
采用 SPSS19.0 统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用配对 t 检验；检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 仿生水凝胶支架观测
仿生水凝胶支架外观呈白色，厚度约 1 mm。扫描电镜观察显示，仿生水凝胶支架具有丰富多孔结构，孔径为 31.7～89.9 μm，平均 60.2 μm。支架置于 PBS 溶液后缓慢降解，9 d 时降解率约为 48%，15 d 时约为 83%，18 d 时约为 95%。见图 2。
图2
仿生水凝胶支架观测
a. 大体观察；b. 扫描电镜观察（×500）；c. 支架降解率
Figure2. Observation of biomimetic hydrogel scaffolda. Gross observation; b. Scanning electron microscope observation (×500); c. Degradation rate of the scaffold
2.2 一般情况
术后动物均存活至实验完成，恢复正常肢体活动。切口愈合良好，无感染发生。
2.3 大体观察
术后 4、8 周，两组标本冈上肌无萎缩，冈上肌肌腱与止点骨床愈合良好，腱-骨连接部界限不明显，未见明显缺损和再撕裂。两组组内 4、8 周观察情况无明显差异。见图 3。
图3
术后各时间点两组大体观察
a. 对照组术后 4 周；b. 实验组术后 4 周；c. 对照组术后 8 周；d. 实验组术后 8 周
Figure3. Gross observation of tendon-to-bone healing in both groups at each time point after operationa. Control group at 4 weeks; b. Experimental group at 4 weeks; c. Control group at 8 weeks; d. Experimental group at 8 weeks
2.4 Micro-CT 检测
术后 4、8 周，两组肌腱止点骨床未见明显差异。见图 4。术后 4、8 周两组 TMD、BMD 和 BV/TV 差异均无统计学意义（P>0.05）；对照组组内术后 4、8 周 BV/TV 差异有统计学意义（t=5.413，P=0.003），两组组内其他指标 4、8 周间比较差异均无统计学意义（P>0.05）。见表 1。
表1
术后各时间点两组 Micro-CT 检测结果（n=6，）
Table1.
Micro-CT analysis in both groups at each time point after operation (n=6, )
图4
术后各时间点两组 Micro-CT 观察
a. 对照组术后 4 周；b. 实验组术后 4 周；c. 对照组术后 8 周；d. 实验组术后 8 周
Figure4. Micro-CT images of both groups at each time point after operationa. Control group at 4 weeks; b. Experimental group at 4 weeks; c. Control group at 8 weeks; d. Experimental group at 8 weeks
2.5 组织学观察
术后 4 周，对照组腱-骨界面以纤维瘢痕为主，界面间无明显间隙，肌腱纤维排列大致正常；实验组腱-骨界面部分区域可见矿化软骨和少量纤维软骨形成，排列紊乱，界面间无明显间隙，无支架残留、炎症反应和肉芽组织形成，肌腱纤维排列大致正常。术后 8 周，对照组腱-骨界面仍以纤维瘢痕为主，局部可见少量软骨，肌腱纤维排列正常；实验组腱-骨界面部分区域可见矿化软骨和纤维软骨有序排列成过渡结构，界面间无明显间隙，肌腱纤维排列正常。见图 5。
图5
术后各时间点两组 HE 染色观察（×100）
B 表示骨组织，I 表示腱-骨界面，T 表示肌腱 a. 对照组术后 4 周；b. 实验组术后4 周；c. 对照组术后 8 周；d. 实验组术后 8 周
Figure5. HE staining of both groups at each time point after operation (×100)B indicated bone, I indicated tendon-to-bone interface, T indicated tendon a. Control group at 4 weeks; b. Experimental group at 4 weeks; c. Control group at 8 weeks; d. Experimental group at 8 weeks
对照组和实验组术后 4 周肌腱成熟度评分分别为（12.5±1.0）、（16.8±0.8）分，术后 8 周分别为（16.2±0.8）、（23.0±1.1）分。术后 4、8 周，实验组肌腱成熟度评分均优于对照组，差异有统计学意义（t=6.500，P=0.001；t=10.448，P=0.000）。 对照组和实验组组内术后 4、8 周肌腱成熟度评分，差异均有统计学意义（t=7.416，P=0.001；t=12.921，P=0.000）。
2.6 生物力学测定
两组标本均于腱-骨界面处拉断。术后 4 周对照组和实验组极限负荷、刚度差异均无统计学意义（P>0.05）；术后 8 周实验组极限负荷明显优于对照组，差异有统计学意义（t=4.162，P=0.009），刚度比较差异无统计学意义（t=2.286，P=0.071）。两组组内术后 8 周极限负荷及刚度均优于 4 周，差异有统计学意义（P<0.05）。见表 2。
表2
术后各时间点两组生物力学测定结果（n=6，）
Table2.
Biomechanical test in both groups at each time point after operation (n=6, )
3 讨论
正常肩袖腱-骨界面由肌腱、纤维软骨、矿化软骨和骨组织四层逐渐过渡结构形成，而肩袖修补术后腱-骨界面的多层过渡结构被瘢痕替代，导致肩袖力学性能减弱，存在再断裂可能。通过组织工程方法改变腱-骨界面愈合方式，重建正常腱-骨止点结构，是提高肩袖修补术疗效的重要研究方向，近年相关研究对于种子细胞及生物材料的选择、支架的设计、生长因子的应用等方面进行了深入探讨[18]。
BMSCs、脂肪干细胞、滑囊干细胞、肌腱干细胞、骨膜干细胞等干细胞具有多向分化潜能，可以促进腱-骨止点的修复。但作为种子细胞，脂肪干细胞存在更新能力差、定向诱导机制仍不明确等不足；滑囊干细胞需要在体外分离和培养，目前仍处于研究早期；肌腱干细胞存在含量少、分离和纯化困难等问题；骨膜干细胞数量较少，限制了其在肩袖修复中的应用[19]。而 BMSCs 是目前研究应用最多的干细胞，具有多向分化特性、分泌生物活性分子、提供再生微环境等优势，是一种具有应用前景的组织工程种子细胞[20]。但目前干细胞技术面临程序耗时、细胞来源缺乏、分化调节不确定、宿主可能发生免疫反应、难以储存和运输等问题，增加了临床转化的难度[21]。为了便于临床应用，需要简便快速的方法来获取 BMSCs。微骨折技术是目前临床上获得 BMSCs 的有效途径之一，可用于关节软骨缺损的修复和促进肩袖腱-骨愈合[11-12]，手术过程中直接在肩袖止点骨床上钻孔，无需通过额外侵袭性手术来获取种子细胞，未明显增加手术创伤和延长手术时间，很好地解决了干细胞来源问题。Kida 等[22]发现在大结节骨床钻孔可以让 BMSCs 从骨髓中渗透，参与肩袖修复，促进肩袖愈合。Bilsel 等[11]通过慢性肩袖损伤动物模型，研究微骨折技术对肩袖愈合的影响。生物力学和组织学观察结果显示，微骨折技术能够促进腱-骨愈合。Milano 等[23]报道了关节镜下肩袖修补术中应用微骨折技术的疗效，对于涉及冈上肌和冈下肌的大肩袖撕裂，微骨折组的治愈率显著提高。Snyder 等[24]认为通过微骨折技术能够在肩袖止点骨床区域形成富含 BMSCs、生长因子和促血管生成因子的纤维蛋白凝块，诱导细胞迁移和增殖，促进腱-骨愈合。
除了干细胞，组织工程支架也是促进腱-骨愈合的有效途径之一。BMSCs 与组织工程支架的联合应用能够更好地修复肩袖损伤[25]。理想的组织工程支架降解速率应与组织形成速率匹配，同时具有适合细胞生长和营养物质交换的三维结构[26-27]。利用冷冻干燥法可以制备具有合适孔径、孔隙相对均匀、连通性好的多孔支架，还能避免支架表面生物活性分子的破坏[26]。本研究选择该方法制备了仿生水凝胶支架，扫描电镜观察显示获得的支架具有丰富的多孔结构，平均孔径为 60.2 μm，这种大小的孔径有利于细胞穿透和骨软骨的形成[28]。体外降解性能测试显示，支架 9 d 时降解率约为 48%，15 d 时约为 83%。而肩袖修补术后愈合过程可以分成炎症反应期（0～7 d）、修复期（5～14 d）和重塑期（>14 d）3 个阶段[29]，结合体外降解实验结果，本研究制备的仿生水凝胶支架降解速率能够满足腱-骨界面修复的需求，不会阻碍腱-骨愈合。
本研究 Micro-CT 检测未发现仿生水凝胶支架对腱-骨界面新骨形成有促进作用，但组织学观察提示术后 4 周实验组腱-骨界面部分区域有少量软骨组织，未见支架残留和炎症反应，进一步说明制备的仿生水凝胶支架降解速率能满足腱-骨界面修复的要求，同时具有良好的组织相容性，而且随着时间的推移，实验组软骨排列更加有序。生物力学测试结果表明，术后 8 周实验组极限负荷明显大于对照组，说明实验组腱-骨结构抗拉性能优于对照组。Dai 等[30]用制备的多孔纤维蛋白支架修复兔软骨缺损，在不添加外源性细胞的前提下，实现了原位软骨修复。Sofu 等[31]运用微骨折技术联合透明质酸支架修复膝关节软骨缺损，结果显示与单纯微骨折处理相比，联合使用透明质酸支架能更好地促进软骨修复，取得更好疗效。本研究结果也表明，与单纯微骨折处理相比，微骨折技术联合仿生水凝胶支架能够更好地促进腱-骨界面多层结构的修复。
综上述，仿生水凝胶支架具有较好的理化性质和组织相容性，与微骨折技术联合使用，可以更好地促进肩袖腱-骨愈合，增强腱-骨界面抗拉性能，有望用于肩袖损伤的再生与修复。但本研究还存在一些不足，如未进行体外细胞实验，未设置假手术组和单纯切断缝合对照组、标本数量偏少，由于动物肩关节解剖结构和运动特点，无法完全模拟人肩袖损伤及愈合过程。另外，由于本研究使用的是急性肩袖损伤模型，仿生水凝胶支架对慢性肩袖损伤的修复作用有待进一步研究。
作者贡献：程飚、赵松负责整体科研设计；黄成龙负责实验实施、数据收集整理、统计分析及文章撰写；陈刚和潘界恩参与实验实施。
利益冲突：所有作者声明，在课题研究和文章撰写过程中不存在利益冲突。项目经费支持没有影响文章观点和对研究数据客观结果的统计分析及其报道。
机构伦理问题：研究方案经嘉兴学院附属第二医院医学伦理委员会批准（jxey-2020SZ048）。实验动物生产许可证号：SCXK（沪）2017-0008，使用许可证号：SYXK（沪）2016-0020。
