孙瑞 1,2 , 于德水 1
  • 1. 锦州医科大学附属第一医院骨创伤科(辽宁锦州 121000);
  • 2. 辽宁省健康产业集团阜新矿业集团总医院骨科(辽宁阜新 123000);
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目的 探讨抑制 miR-429 改善体外血脊髓屏障(blood spinal cord barrier,BSCB)通透性的可行性及机制,为改善脊髓微环境提供新的基因治疗靶点。方法 首先,取永生化人脑微血管内皮细胞系(hCMEC/D3),应用 miR-429 拮抗剂 antagomiR-429 及其阴性对照 antagomiR-429-NC 进行转染,通过荧光显微镜观察以及实时荧光定量 PCR 检测 miR-429 表达,验证 antagomiR-429 转染效率。然后观察 miR-429 对体外 BSCB 通透性的影响。实验分为 4 组,其中空白对照组(A 组)为正常 hCMEC/D3 细胞、Ha-sc 细胞构建 BSCB 模型,低氧诱导组(B 组)、低氧诱导+antagomiR-429-NC 组(C 组)、低氧诱导+antagomiR-429 组(D 组)分别采用正常、antagomiR-429-NC 转染以及 antagomiR-429 转染的 hCMEC/D3 细胞,与 Ha-sc 细胞构建 BSCB 模型并低氧处理 12 h。通过辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)通量测定体外 BSCB 通透性,实时荧光定量 PCR、Western Blot 和免疫荧光染色观测内皮细胞中紧密连接蛋白 ZO-1、Occludin、Claudin-5 的表达水平。结果 荧光显微镜下观察 antagomiR-429 及 antagomiR-429-NC 成功转染至 hCMEC/D3 细胞,转染效率约为 90%;实时荧光定量 PCR 检测 antagomiR-429 组 miR-429 相对表达量为 0.109±0.013,明显低于 antagomiR-429-NC 组的 0.956±0.0037(P<0.05)。HRP 通透性测量、实时荧光定量 PCR 及 Western blot 检测显示,B、C 组 HRP 通透性明显高于 A、D 组,ZO-1、Occludin 和 Claudin-5 蛋白及 mRNA 相对表达量均明显低于 A、D 组(P<0.05);B、C 组间差异无统计学意义(P>0.05),D 组尚未达 A 组水平(P<0.05)。免疫荧光染色观察示 D 组 ZO-1、Occludin 和 Claudin-5 蛋白在细胞膜边界免疫荧光较 B、C 组增强,但尚未达 A 组程度。结论 通过抑制 miR-429 表达可促进微血管内皮细胞中 ZO-1、Occludin 和 Claudin-5 蛋白表达,进而改善因低氧导致的 BSCB 通透性增高。