• 桂林医学院附属医院四肢创伤骨科(广西桂林 541000);
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目的 探索沉默 P75 神经营养蛋白受体(p75 neurotrophin receptor,P75NTR)联合 NGF 过表达对大鼠 BMSCs 增殖活性和复合脱钙骨基质(demineralized bone matrix,DBM)构建组织工程骨异位成骨能力的影响。方法 通过贴壁分离法培养 SD 大鼠 BMSCs 并传代。取第 3 代 BMSCs,分别用慢病毒介导沉默 P75NTR 基因(B 组)、NGF 过表达基因(C 组)、沉默 P75NTR 和 NGF 过表达双基因(D 组)转染,以未转染细胞作为对照(A 组)。转染 7 d 后荧光显微镜观察目的基因荧光蛋白表达;细胞计数试剂盒 8 法检测转染后连续 8 d 细胞的活性;Western blot 检测各组 P75NTR 和 NGF 蛋白表达。倒置相差显微镜和扫描电镜分别观察沉默 P75NTR 和 NGF 过表达双基因转染后 BMSCs 与 DBM 的黏附情况。将上述 4 组转染后 BMSCs 分别与 DBM 共培养制备组织工程骨后,埋植于 8 周龄 SD 大鼠背侧皮下构建皮下异位成骨模型(n=6),术后 4、8 周行 HE 染色,术后 8 周 ALP 染色观察钙结节形成,实时荧光定量 PCR 检测成骨相关基因 Runt 相关转录因子 2(Runt-related transcription factor 2,Runx2)、ALP 和骨钙素(osteocalcin,OCN)表达。结果 转染 7 d A 组未见荧光表达,B 组呈红色荧光表达,C 组呈绿色荧光表达,D 组呈红绿色复合荧光表达;目的基因荧光表达率可达 70% 左右。Western blot 检测示,A、C 组 P75NTR 蛋白相对表达量显著高于 B、D 组,C、D 组 NGF 蛋白相对表达量显著高于 A、B 组,差异均有统计学意义(P<0.05)。随时间推移,各组细胞增殖活性均上升,其中 D 组上升最明显,3~8 d 细胞活性明显高于 A 组(P<0.05)。倒置相差显微镜和扫描电镜观察示,BMSCs 能与 DBM 形成良好黏附。皮下异位成骨实验中,HE 染色示术后 4、8 周,D 组比其余 3 组有更多的骨组织形成。ALP 染色示 D 组 ALP 活性最高,有更好的成骨表达。实时荧光定量 PCR 检测示,与 A 组比较,D 组 Runx2、ALP、OCN mRNA 相对表达量显著升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 沉默 P75NTR 联合 NGF 过表达双基因共转染 BMSCs 复合 DBM 构建组织工程骨具有良好的异位成骨能力,通过提高 NGF 的水平、关闭 P75NTR 凋亡通道,不仅可以提高细胞活性,还能更好地促进骨组织再生。

引用本文: 陈俊毅, 王宁, 张衡, 张贤平, 赵利民, 朱伦井, 黎智君, 贝朝涌. 慢病毒介导沉默 P75 神经营养蛋白受体联合 NGF 过表达转染 BMSCs 复合脱钙骨基质异位成骨的实验研究. 中国修复重建外科杂志, 2020, 34(11): 1438-1445. doi: 10.7507/1002-1892.202003166 复制

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