骨折具有较高发生率和致残率，严重威胁患者生活质量，治疗不当会引起骨愈合延迟及骨质坏死[1]。探究骨折愈合的分子机制，寻找促进骨折愈合的方法，是目前研究热点之一。研究发现，甲状旁腺激素（parathyroid hormone，PTH）可调控成骨细胞生存、增殖及分化[2]，并能通过介导PTH1 受体（PTH1 receptor，PTH1R）调控成骨形成，参与骨折愈合过程[3]。但近来研究发现，软骨内成骨也参与了骨折愈合过程[4]，PTH 能否调控软骨内成骨尚未见报道。另外，能调节软骨细胞增殖分化、促进软骨内成骨的重要调节因子——印度豪猪（Indian Hedgehog，Ihh）也可通过介导 PTH1R 调控成骨，参与骨折愈合过程[5-6]。但 Ihh 调控软骨内成骨途径促进骨折愈合的作用机制是否与 PTH 有关也未见报道。本研究在对股骨骨折模型小鼠给予外源性 PTH 基础上，通过 Ihh 软骨内成骨途径，探究 Ihh 通路在 PTH 促进骨折愈合过程中的作用，以期为 PTH 的临床应用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂、仪器
同遗传背景 6～7 周龄 C57BL/6J 雄性小鼠 50 只，体质量 20～22 g，由江苏大学实验动物中心提供。饲养于江苏大学清洁级、SPF 级实验动物中心，饲养条件：自然光照，自由饮食、水，温度 25℃，相对湿度 50%。实验动物遵循 3R 原则。
PTH 促进剂 hPTH1-34（一种抗骨质疏松药；广州特立生物科技有限公司）；Ihh 通路阻断剂环靶明（cyclopamine，CPM；北京伊诺凯科技有限公司）；HE 染色试剂盒（上海捷瑞生物工程有限公司）；ALP ELISA 试剂盒（上海广锐生物科技有限公司）；磷（P）ELISA 试剂盒（江苏博深生物科技有限公司）；钙（Ca）ELISA 试剂盒（上海奥陆生物科技有限公司）；蛋白裂解液（上海碧云天生物技术研究所）；Ihh 抗体、Ihh 通路相关蛋白-跨膜转导蛋白（Smothend，Smo）抗体、GLI 家族锌指蛋白 1（Gli1）抗体、PTH1R 抗体、性别决定区 Y 框蛋白 9（sex determining region Y box protein 9，Sox9）抗体、β-肌动蛋白（β-actin）抗体、辣根过氧化物酶标记羊抗鼠二抗（Abcam 公司，美国）；BCA 蛋白定量试剂盒、胰蛋白酶（Pierce 公司，美国）。RM2125RTS 手动轮转式切片机（Leica 公司，德国）；SMZ745 光学显微镜（Nikon 公司，日本）；1659001 蛋白电泳仪、Trans-Blot SD 半干转膜仪（Bio-Rad 公司，美国）；GIS-500 凝胶成像仪（杭州米欧仪器有限公司）。
1.2 小鼠股骨骨折模型建立及分组
取 50 只小鼠按随机数字表法分为 5 组，分别为正常组（A 组）、股骨骨折模型组（B 组）、hPTH1-34 组（C 组）、CPM 组（D 组）、hPTH1-34+CPM 组（E 组），每组 10 只。除 A 组外，其余 4 组小鼠均参照文献［7］方法构建右侧股骨开放性骨折髓内针固定模型，并摄 X 线片检查造模后股骨形态，若骨折线清晰可见，提示造模成功。造模后 C、D、E 组分别皮下注射 40 μg/kg hPTH1-34、1.2 mg/kg CPM 及 40 μg/kg hPTH1-34+1.2 mg/kg CPM（剂量参考文献［8-9］），A、B 组皮下注射等量生理盐水，1 次/d，共 14 d。
1.3 观测指标
1.3.1 ELISA 检测血清 ALP、Ca、P 含量
末次给药后禁食、水 12 h，腹腔注射 3% 戊巴比妥钠（1 mL/kg）麻醉小鼠，取尾静脉血 3 mL 置于肝素钠抗凝管中，抗凝 15 min 后，以离心半径 16 cm、3 000 r/min 离心 10 min，取上清液，置于−20℃ 冰箱保存备用。检测时取血清样品置于 4℃ 冰箱解冻后，按 ELISA 试剂盒说明，分别检测血清 ALP、Ca、P 含量。
1.3.2 X 线片观察股骨骨折愈合情况
取血后断头处死小鼠，取右后肢完整股骨，剔除周围肌肉组织，取出髓内固定装置，摄 X 线片观察骨折愈合情况；并按文献［10］标准对每个标本进行骨折愈合评分，评分越高提示骨折愈合情况越好。
1.3.3 骨痂体积计算
X 线片观察后，用游标卡尺测量骨痂最大半径（R1）、长度（L）及股骨干半径（R2），根据以下公式计算骨痂体积：2πR2×（R1−R2）×L。
1.3.4 骨痂标本组织学观察
骨痂体积测量后，以骨折断端为中心截取长约 1 cm 股骨（包括骨痂和骨组织），用小刀刮取骨折线处结痂组织 0.5 g（A 组同部位刮取骨膜组织），置于−80℃ 冰箱中保存。其余股骨组织迅速置于 4% 中性多聚甲醛中固定 24 h，用 EDTA 脱钙液脱钙 2 周后，取骨痂，经透明、浸蜡、包埋后行 14 μm 厚冰冻切片，常规行 HE 染色及番红 O-固绿染色，光镜下观察。番红 O-固绿染色中软骨组织呈红色，钙化骨组织呈绿色。
1.3.5 Western blot 检测骨痂组织相关蛋白表达
取骨痂组织，加入蛋白裂解液匀浆后以离心半径8 cm、12 000 r/min 离心 5 min；取上清液用 BCA 法检测蛋白总浓度，取 50 μg 蛋白进行电泳和转膜反应、封闭液封闭后，加入 Ihh、Smo、Gli1、PTH1R、Sox9 一抗（1∶500），内参为 β-actin（1∶1 000），4℃ 孵育过夜及振洗后，加入辣根过氧化物酶标记羊抗鼠二抗（1∶2 000）室温孵育 1 h；行增强化学发光法显色，凝胶成像仪观察条带并拍照，以 Image-J 软件分析各组各蛋白相对表达量。
1.4 统计学方法
采用 SPSS22.0 统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用 LSD 检验；检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 ELISA 检测血清 ALP、Ca、P 含量
B～E 组小鼠血清 ALP、Ca、P 含量显著高于 A 组，C 组高于 B、E 组，D 组低于 B、E 组，差异均有统计学意义（P<0.05）；B、E 组间差异无统计学意义（P>0.05）。见图 1。
图1
ELISA 检测各组小鼠血清 ALP、Ca、P 含量
a. ALP；b. Ca；c. P
Figure1. ELISA detection of serum ALP, Ca, P content of mice in each groupa. ALP; b. Ca; c. P
2.2 X 线片观察股骨骨折愈合情况
X 线片示，A 组股骨形态正常；B、E 组骨折断端边缘模糊，骨膜密度较淡，有少量骨痂形成；C 组骨折断端边缘接近消失，骨膜密度较深，骨痂增多；D 组骨折断端边缘趋向模糊，骨膜轻度反应，无骨痂。见图 2。A～E 组骨折愈合评分分别为（4.0±0.0）、（1.9±0.1）、（3.5±0.1）、（0.5±0.1）、（1.9±0.1）分，B～E 组显著低于 A 组，C 组高于 B、E 组，D 组低于 B、E 组，差异均有统计学意义（P<0.05）；B、E 组间差异无统计学意义（P>0.05）。
图2
X 线片观察各组小鼠股骨骨折愈合情况
a. A 组；b. B 组；c. C 组；d. D 组；e. E 组
Figure2. X-ray film observation of femoral fractures healing of mice in each groupa. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D; e. Group E
2.3 骨痂体积计算
A～E 组骨痂体积分别为 0、（102.46±10.00）、（196.35±11.22）、（62.46±9.83）、（107.02±10.21）mm3，B～E 组显著高于 A 组，C 组高于 B、E 组，D 组低于 B、E 组，差异均有统计学意义（P<0.05）；B、E 组间差异无统计学意义（P>0.05）。
2.4 骨痂标本组织学观察
HE 染色示，A 组骨组织细胞正常；B、E 组骨折端可见软骨骨痂和硬骨骨痂形成，有大量骨小梁及软骨细胞形成；C 组纤维骨痂形成增多，骨膜下骨小梁进一步生长，软骨细胞内夹杂钙化骨形成；D 组骨小梁及软骨细胞形成最少。见图 3。
图3
各组小鼠股骨骨组织 HE 染色观察（×200）
a. A 组；b. B 组；c. C 组；d. D 组；e. E 组
Figure3. HE staining observation of femur bone tissue in each group (×200)a. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D; e. Group E
番红 O-固绿染色示，A 组可见大量软骨组织及钙化骨组织。B、E 组肥大软骨细胞较 A 组增多，钙化骨组织较 A 组减少。C 组肥大软骨细胞及钙化骨组织较 B、E 组进一步增多。D 组软骨细胞及钙化骨组织较 B、E 组明显减少。见图 4。
图4
各组小鼠股骨骨组织番红 O-固绿染色观察（×400）
a. A 组；b. B 组；c. C 组；d. D 组；e. E 组
Figure4. Observation of femur bone tissue by Safranin O-fast green staining (×400)a. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D; e. Group E
2.5 Western blot 检测骨痂组织相关蛋白表达
B～E 组骨痂组织中 Ihh、Smo、Gli1、PTH1R 及 Sox9 蛋白相对表达量均显著高于 A 组，C 组高于 B、E 组，D 组低于 B、E 组，差异均有统计学意义（P<0.05）；B、E 组间差异无统计学意义（P>0.05）。见图 5、6。
图5
Western blot 检测各组小鼠骨痂组织各蛋白表达
1：A 组 2：B 组 3：E 组 4：C 组 5：D 组
Figure5. Western blot detection of protein expressions in the callus tissue of each group1：Group A 2：Group B 3：Group E 4：Group C 5：Group D
图6
Western blot 检测各组小鼠骨痂组织各蛋白相对表达量
a. Ihh；b. Smo；c. Gli1；d. PTH1R；e. Sox9
Figure6. Western blot detection of the relative expressions of each protein in the callus tissue of each groupa. Ihh; b. Smo; c. Gli1; d. PTH1R; e. Sox9
3 讨论
骨折采用单纯外科方法治疗可能存在骨折愈合周期长、延迟愈合或不愈合等情况，使得治疗效果欠佳。因此寻找促进骨折愈合方法，一直是临床研究热点之一。开放性破坏骨组织连续+髓内针固定制备的小鼠骨折模型，是模拟骨折的理想模型[11-12]。故本研究建立小鼠髓内针固定开放性骨折模型，与 A 组相比，X 线片检测示 B 组小鼠骨折断端边缘模糊，有少量骨痂形成且骨折愈合评分较低；HE 染色可见有软骨骨痂和硬骨骨痂形成，骨折断端间主要为纤维性连接；骨痂体积较小；血清中骨愈合所需矿物质 Ca、P 及 ALP 含量明显升高。提示 B 组小鼠骨折部位存在骨愈合现象，表明造模成功。
激素及受体、细胞因子、微量元素等多种化学因素均参与骨代谢和骨愈合调节[13]。PTH 是血液中 Ca、P 浓度及骨细胞活性的调节因子[3]。人工合成的 hPTH1-34 是 PTH 类似物，具有 PTH 全分子活性，是现今临床唯一推荐使用的促骨形成剂，可用于治疗骨质疏松性骨折[14]。本研究发现，与 B 组相比，C 组小鼠骨折断端边缘接近消失，骨膜密度较深，骨痂量增多，骨痂质地较硬，骨小梁间隙可见丰富的毛细血管生成；且骨折愈合评分，骨痂体积，血清 Ca、P、ALP 含量均升高，提示 C 组骨折愈合情况好于 B 组，hPTH1-34 可促进骨折愈合。然而，目前对 hPTH1-34 促进骨折愈合的机制研究仍停留在促进成骨细胞增殖和分化、抑制成骨细胞凋亡方面[15]。周浩等[16]发现 PTH 基因缺失可抑制软骨内成骨过程而导致骨愈合延迟，表明 hPTH1-34 也可能通过某种途径促进软骨细胞增殖、分化来促进骨愈合。本研究对此进行探究和验证，以期阐明 hPTH1-34 促进骨愈合的其他可能新机制。
骨损伤的修复方式包括膜内成骨和软骨内成骨，软骨内成骨的修复机制分为软骨细胞分泌软骨基质、软骨细胞肥大和钙化、破骨细胞吸收钙化软骨基质、血管和成骨细胞进入钙化区域形成骨等步骤，且这些步骤有序进行才能保持良好的骨再生，若任何一步骤出现异常，都可能使骨愈合延迟甚至不愈合[17]。Sox9 为软骨内成骨标志物，研究证实 Sox9 可在软骨前体细胞、软骨细胞及软骨细胞肥大阶段持续高表达，并能诱导软骨细胞分化[18]。Liang 等[19]发现 Sox9 缺陷小鼠会出现严重的软骨发育不良及骨结构丢失现象，说明 Sox9 在软骨形成及骨形成中发挥重要调控作用。本研究结果显示，B 组小鼠骨痂组织中 Sox9 表达显著高于 A 组，且番红 O-固绿染色也检测到红染的肥大软骨细胞及绿染钙化骨组织增多，提示软骨内成骨可能参与了骨损伤修复过程。
PTH1R 可刺激软骨细胞增殖、分化[20]。Ding 等[21]发现内源性 PTH 基因缺失可导致骨折延迟愈合，预示 PTH 可能在骨折愈合中起重要调控作用。Ihh 可调节软骨细胞增殖分化，是骨发育时期软骨内成骨过程中的重要调控因子，也是较好的软骨生成剂，可促进骨折愈合[22]。Amano 等[23]发现 Ihh 可在膜蛋白受体介导下解除 Smo 的抑制作用，激活细胞释放 Gli1，并促进软骨膜释放成骨细胞活性因子，从而调节软骨内成骨生成。然而 Ihh 与 PTH 之间的调控作用研究较少。本研究结果显示，给予小鼠外源性 PTH 促进剂 hPTH1-34 后，C 组小鼠骨痂组织中软骨内成骨通路蛋白 Ihh、Smo、Gli1 及 PTH1R 蛋白表达显著高于 A 组，同时伴随着 Sox9 蛋白表达增高、肥大软骨细胞及钙化骨形成进一步增多，骨折愈合效果最好，提示 PTH 促进骨折愈合的作用可能与激活 Ihh/Smo/Gli1 通路介导的软骨内成骨骨损伤修复途径有关。而用 CPM 阻断 Ihh 表达后，D 组小鼠骨痂组织中 Ihh、Smo、PTH1R、Gli1 及 Sox9 蛋白表达显著降低，软骨组织丢失，骨折愈合效果最差，提示阻断 Ihh 通路可造成软骨内成骨形成障碍，骨折愈合延迟。另外，Ihh 通路阻断剂与 hPTH1-34 联合应用时，小鼠各项骨愈合指标均差于 C 组，表明 Ihh 通路阻断剂可逆转 hPTH1-34 促进骨折愈合的作用。
综上述，hPTH1-34 促进骨折愈合的作用与激活 PTH/PTH1R/Ihh 通路介导的软骨内成骨骨损伤修复途径有关，Ihh 通路阻断剂可逆转 hPTH1-34 对骨折愈合的促进作用。本研究为阐明 PTH 促进骨折愈合的机制提供了实验依据。但骨折愈合过程中，膜内成骨和软骨内成骨修复机制复杂且联系密切，Sox9 与 PTH 及 Ihh 的靶向调控作用还不明确，有待进一步验证。
作者贡献：孙周负责文章撰写、实验设计及实施；汪雷、袁即山、邱健负责实验设计及实施、数据收集；肖黎、吕斌指导数据统计分析；丁华指导实验并对文章的知识性内容作批评性审阅。
利益冲突：所有作者声明，在课题研究及文章撰写中不存在相关利益冲突。课题经费支持没有影响文章观点及对实验数据客观结果的统计分析及报道。
机构伦理问题：研究方案经江苏大学附属人民医院伦理委员会批准（伦审 2019-1217）。实验动物生产许可证号：SCXK（苏）2019-0006，实验动物使用许可证号：SYXK（苏）2019-0012。
骨折具有较高发生率和致残率，严重威胁患者生活质量，治疗不当会引起骨愈合延迟及骨质坏死[1]。探究骨折愈合的分子机制，寻找促进骨折愈合的方法，是目前研究热点之一。研究发现，甲状旁腺激素（parathyroid hormone，PTH）可调控成骨细胞生存、增殖及分化[2]，并能通过介导PTH1 受体（PTH1 receptor，PTH1R）调控成骨形成，参与骨折愈合过程[3]。但近来研究发现，软骨内成骨也参与了骨折愈合过程[4]，PTH 能否调控软骨内成骨尚未见报道。另外，能调节软骨细胞增殖分化、促进软骨内成骨的重要调节因子——印度豪猪（Indian Hedgehog，Ihh）也可通过介导 PTH1R 调控成骨，参与骨折愈合过程[5-6]。但 Ihh 调控软骨内成骨途径促进骨折愈合的作用机制是否与 PTH 有关也未见报道。本研究在对股骨骨折模型小鼠给予外源性 PTH 基础上，通过 Ihh 软骨内成骨途径，探究 Ihh 通路在 PTH 促进骨折愈合过程中的作用，以期为 PTH 的临床应用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂、仪器
同遗传背景 6～7 周龄 C57BL/6J 雄性小鼠 50 只，体质量 20～22 g，由江苏大学实验动物中心提供。饲养于江苏大学清洁级、SPF 级实验动物中心，饲养条件：自然光照，自由饮食、水，温度 25℃，相对湿度 50%。实验动物遵循 3R 原则。
PTH 促进剂 hPTH1-34（一种抗骨质疏松药；广州特立生物科技有限公司）；Ihh 通路阻断剂环靶明（cyclopamine，CPM；北京伊诺凯科技有限公司）；HE 染色试剂盒（上海捷瑞生物工程有限公司）；ALP ELISA 试剂盒（上海广锐生物科技有限公司）；磷（P）ELISA 试剂盒（江苏博深生物科技有限公司）；钙（Ca）ELISA 试剂盒（上海奥陆生物科技有限公司）；蛋白裂解液（上海碧云天生物技术研究所）；Ihh 抗体、Ihh 通路相关蛋白-跨膜转导蛋白（Smothend，Smo）抗体、GLI 家族锌指蛋白 1（Gli1）抗体、PTH1R 抗体、性别决定区 Y 框蛋白 9（sex determining region Y box protein 9，Sox9）抗体、β-肌动蛋白（β-actin）抗体、辣根过氧化物酶标记羊抗鼠二抗（Abcam 公司，美国）；BCA 蛋白定量试剂盒、胰蛋白酶（Pierce 公司，美国）。RM2125RTS 手动轮转式切片机（Leica 公司，德国）；SMZ745 光学显微镜（Nikon 公司，日本）；1659001 蛋白电泳仪、Trans-Blot SD 半干转膜仪（Bio-Rad 公司，美国）；GIS-500 凝胶成像仪（杭州米欧仪器有限公司）。
1.2 小鼠股骨骨折模型建立及分组
取 50 只小鼠按随机数字表法分为 5 组，分别为正常组（A 组）、股骨骨折模型组（B 组）、hPTH1-34 组（C 组）、CPM 组（D 组）、hPTH1-34+CPM 组（E 组），每组 10 只。除 A 组外，其余 4 组小鼠均参照文献［7］方法构建右侧股骨开放性骨折髓内针固定模型，并摄 X 线片检查造模后股骨形态，若骨折线清晰可见，提示造模成功。造模后 C、D、E 组分别皮下注射 40 μg/kg hPTH1-34、1.2 mg/kg CPM 及 40 μg/kg hPTH1-34+1.2 mg/kg CPM（剂量参考文献［8-9］），A、B 组皮下注射等量生理盐水，1 次/d，共 14 d。
1.3 观测指标
1.3.1 ELISA 检测血清 ALP、Ca、P 含量
末次给药后禁食、水 12 h，腹腔注射 3% 戊巴比妥钠（1 mL/kg）麻醉小鼠，取尾静脉血 3 mL 置于肝素钠抗凝管中，抗凝 15 min 后，以离心半径 16 cm、3 000 r/min 离心 10 min，取上清液，置于−20℃ 冰箱保存备用。检测时取血清样品置于 4℃ 冰箱解冻后，按 ELISA 试剂盒说明，分别检测血清 ALP、Ca、P 含量。
1.3.2 X 线片观察股骨骨折愈合情况
取血后断头处死小鼠，取右后肢完整股骨，剔除周围肌肉组织，取出髓内固定装置，摄 X 线片观察骨折愈合情况；并按文献［10］标准对每个标本进行骨折愈合评分，评分越高提示骨折愈合情况越好。
1.3.3 骨痂体积计算
X 线片观察后，用游标卡尺测量骨痂最大半径（R1）、长度（L）及股骨干半径（R2），根据以下公式计算骨痂体积：2πR2×（R1−R2）×L。
1.3.4 骨痂标本组织学观察
骨痂体积测量后，以骨折断端为中心截取长约 1 cm 股骨（包括骨痂和骨组织），用小刀刮取骨折线处结痂组织 0.5 g（A 组同部位刮取骨膜组织），置于−80℃ 冰箱中保存。其余股骨组织迅速置于 4% 中性多聚甲醛中固定 24 h，用 EDTA 脱钙液脱钙 2 周后，取骨痂，经透明、浸蜡、包埋后行 14 μm 厚冰冻切片，常规行 HE 染色及番红 O-固绿染色，光镜下观察。番红 O-固绿染色中软骨组织呈红色，钙化骨组织呈绿色。
1.3.5 Western blot 检测骨痂组织相关蛋白表达
取骨痂组织，加入蛋白裂解液匀浆后以离心半径8 cm、12 000 r/min 离心 5 min；取上清液用 BCA 法检测蛋白总浓度，取 50 μg 蛋白进行电泳和转膜反应、封闭液封闭后，加入 Ihh、Smo、Gli1、PTH1R、Sox9 一抗（1∶500），内参为 β-actin（1∶1 000），4℃ 孵育过夜及振洗后，加入辣根过氧化物酶标记羊抗鼠二抗（1∶2 000）室温孵育 1 h；行增强化学发光法显色，凝胶成像仪观察条带并拍照，以 Image-J 软件分析各组各蛋白相对表达量。
1.4 统计学方法
采用 SPSS22.0 统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用 LSD 检验；检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 ELISA 检测血清 ALP、Ca、P 含量
B～E 组小鼠血清 ALP、Ca、P 含量显著高于 A 组，C 组高于 B、E 组，D 组低于 B、E 组，差异均有统计学意义（P<0.05）；B、E 组间差异无统计学意义（P>0.05）。见图 1。
图1
ELISA 检测各组小鼠血清 ALP、Ca、P 含量
a. ALP；b. Ca；c. P
Figure1. ELISA detection of serum ALP, Ca, P content of mice in each groupa. ALP; b. Ca; c. P
2.2 X 线片观察股骨骨折愈合情况
X 线片示，A 组股骨形态正常；B、E 组骨折断端边缘模糊，骨膜密度较淡，有少量骨痂形成；C 组骨折断端边缘接近消失，骨膜密度较深，骨痂增多；D 组骨折断端边缘趋向模糊，骨膜轻度反应，无骨痂。见图 2。A～E 组骨折愈合评分分别为（4.0±0.0）、（1.9±0.1）、（3.5±0.1）、（0.5±0.1）、（1.9±0.1）分，B～E 组显著低于 A 组，C 组高于 B、E 组，D 组低于 B、E 组，差异均有统计学意义（P<0.05）；B、E 组间差异无统计学意义（P>0.05）。
图2
X 线片观察各组小鼠股骨骨折愈合情况
a. A 组；b. B 组；c. C 组；d. D 组；e. E 组
Figure2. X-ray film observation of femoral fractures healing of mice in each groupa. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D; e. Group E
2.3 骨痂体积计算
A～E 组骨痂体积分别为 0、（102.46±10.00）、（196.35±11.22）、（62.46±9.83）、（107.02±10.21）mm3，B～E 组显著高于 A 组，C 组高于 B、E 组，D 组低于 B、E 组，差异均有统计学意义（P<0.05）；B、E 组间差异无统计学意义（P>0.05）。
2.4 骨痂标本组织学观察
HE 染色示，A 组骨组织细胞正常；B、E 组骨折端可见软骨骨痂和硬骨骨痂形成，有大量骨小梁及软骨细胞形成；C 组纤维骨痂形成增多，骨膜下骨小梁进一步生长，软骨细胞内夹杂钙化骨形成；D 组骨小梁及软骨细胞形成最少。见图 3。
图3
各组小鼠股骨骨组织 HE 染色观察（×200）
a. A 组；b. B 组；c. C 组；d. D 组；e. E 组
Figure3. HE staining observation of femur bone tissue in each group (×200)a. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D; e. Group E
番红 O-固绿染色示，A 组可见大量软骨组织及钙化骨组织。B、E 组肥大软骨细胞较 A 组增多，钙化骨组织较 A 组减少。C 组肥大软骨细胞及钙化骨组织较 B、E 组进一步增多。D 组软骨细胞及钙化骨组织较 B、E 组明显减少。见图 4。
图4
各组小鼠股骨骨组织番红 O-固绿染色观察（×400）
a. A 组；b. B 组；c. C 组；d. D 组；e. E 组
Figure4. Observation of femur bone tissue by Safranin O-fast green staining (×400)a. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D; e. Group E
2.5 Western blot 检测骨痂组织相关蛋白表达
B～E 组骨痂组织中 Ihh、Smo、Gli1、PTH1R 及 Sox9 蛋白相对表达量均显著高于 A 组，C 组高于 B、E 组，D 组低于 B、E 组，差异均有统计学意义（P<0.05）；B、E 组间差异无统计学意义（P>0.05）。见图 5、6。
图5
Western blot 检测各组小鼠骨痂组织各蛋白表达
1：A 组 2：B 组 3：E 组 4：C 组 5：D 组
Figure5. Western blot detection of protein expressions in the callus tissue of each group1：Group A 2：Group B 3：Group E 4：Group C 5：Group D
图6
Western blot 检测各组小鼠骨痂组织各蛋白相对表达量
a. Ihh；b. Smo；c. Gli1；d. PTH1R；e. Sox9
Figure6. Western blot detection of the relative expressions of each protein in the callus tissue of each groupa. Ihh; b. Smo; c. Gli1; d. PTH1R; e. Sox9
3 讨论
骨折采用单纯外科方法治疗可能存在骨折愈合周期长、延迟愈合或不愈合等情况，使得治疗效果欠佳。因此寻找促进骨折愈合方法，一直是临床研究热点之一。开放性破坏骨组织连续+髓内针固定制备的小鼠骨折模型，是模拟骨折的理想模型[11-12]。故本研究建立小鼠髓内针固定开放性骨折模型，与 A 组相比，X 线片检测示 B 组小鼠骨折断端边缘模糊，有少量骨痂形成且骨折愈合评分较低；HE 染色可见有软骨骨痂和硬骨骨痂形成，骨折断端间主要为纤维性连接；骨痂体积较小；血清中骨愈合所需矿物质 Ca、P 及 ALP 含量明显升高。提示 B 组小鼠骨折部位存在骨愈合现象，表明造模成功。
激素及受体、细胞因子、微量元素等多种化学因素均参与骨代谢和骨愈合调节[13]。PTH 是血液中 Ca、P 浓度及骨细胞活性的调节因子[3]。人工合成的 hPTH1-34 是 PTH 类似物，具有 PTH 全分子活性，是现今临床唯一推荐使用的促骨形成剂，可用于治疗骨质疏松性骨折[14]。本研究发现，与 B 组相比，C 组小鼠骨折断端边缘接近消失，骨膜密度较深，骨痂量增多，骨痂质地较硬，骨小梁间隙可见丰富的毛细血管生成；且骨折愈合评分，骨痂体积，血清 Ca、P、ALP 含量均升高，提示 C 组骨折愈合情况好于 B 组，hPTH1-34 可促进骨折愈合。然而，目前对 hPTH1-34 促进骨折愈合的机制研究仍停留在促进成骨细胞增殖和分化、抑制成骨细胞凋亡方面[15]。周浩等[16]发现 PTH 基因缺失可抑制软骨内成骨过程而导致骨愈合延迟，表明 hPTH1-34 也可能通过某种途径促进软骨细胞增殖、分化来促进骨愈合。本研究对此进行探究和验证，以期阐明 hPTH1-34 促进骨愈合的其他可能新机制。
骨损伤的修复方式包括膜内成骨和软骨内成骨，软骨内成骨的修复机制分为软骨细胞分泌软骨基质、软骨细胞肥大和钙化、破骨细胞吸收钙化软骨基质、血管和成骨细胞进入钙化区域形成骨等步骤，且这些步骤有序进行才能保持良好的骨再生，若任何一步骤出现异常，都可能使骨愈合延迟甚至不愈合[17]。Sox9 为软骨内成骨标志物，研究证实 Sox9 可在软骨前体细胞、软骨细胞及软骨细胞肥大阶段持续高表达，并能诱导软骨细胞分化[18]。Liang 等[19]发现 Sox9 缺陷小鼠会出现严重的软骨发育不良及骨结构丢失现象，说明 Sox9 在软骨形成及骨形成中发挥重要调控作用。本研究结果显示，B 组小鼠骨痂组织中 Sox9 表达显著高于 A 组，且番红 O-固绿染色也检测到红染的肥大软骨细胞及绿染钙化骨组织增多，提示软骨内成骨可能参与了骨损伤修复过程。
PTH1R 可刺激软骨细胞增殖、分化[20]。Ding 等[21]发现内源性 PTH 基因缺失可导致骨折延迟愈合，预示 PTH 可能在骨折愈合中起重要调控作用。Ihh 可调节软骨细胞增殖分化，是骨发育时期软骨内成骨过程中的重要调控因子，也是较好的软骨生成剂，可促进骨折愈合[22]。Amano 等[23]发现 Ihh 可在膜蛋白受体介导下解除 Smo 的抑制作用，激活细胞释放 Gli1，并促进软骨膜释放成骨细胞活性因子，从而调节软骨内成骨生成。然而 Ihh 与 PTH 之间的调控作用研究较少。本研究结果显示，给予小鼠外源性 PTH 促进剂 hPTH1-34 后，C 组小鼠骨痂组织中软骨内成骨通路蛋白 Ihh、Smo、Gli1 及 PTH1R 蛋白表达显著高于 A 组，同时伴随着 Sox9 蛋白表达增高、肥大软骨细胞及钙化骨形成进一步增多，骨折愈合效果最好，提示 PTH 促进骨折愈合的作用可能与激活 Ihh/Smo/Gli1 通路介导的软骨内成骨骨损伤修复途径有关。而用 CPM 阻断 Ihh 表达后，D 组小鼠骨痂组织中 Ihh、Smo、PTH1R、Gli1 及 Sox9 蛋白表达显著降低，软骨组织丢失，骨折愈合效果最差，提示阻断 Ihh 通路可造成软骨内成骨形成障碍，骨折愈合延迟。另外，Ihh 通路阻断剂与 hPTH1-34 联合应用时，小鼠各项骨愈合指标均差于 C 组，表明 Ihh 通路阻断剂可逆转 hPTH1-34 促进骨折愈合的作用。
综上述，hPTH1-34 促进骨折愈合的作用与激活 PTH/PTH1R/Ihh 通路介导的软骨内成骨骨损伤修复途径有关，Ihh 通路阻断剂可逆转 hPTH1-34 对骨折愈合的促进作用。本研究为阐明 PTH 促进骨折愈合的机制提供了实验依据。但骨折愈合过程中，膜内成骨和软骨内成骨修复机制复杂且联系密切，Sox9 与 PTH 及 Ihh 的靶向调控作用还不明确，有待进一步验证。
作者贡献：孙周负责文章撰写、实验设计及实施；汪雷、袁即山、邱健负责实验设计及实施、数据收集；肖黎、吕斌指导数据统计分析；丁华指导实验并对文章的知识性内容作批评性审阅。
利益冲突：所有作者声明，在课题研究及文章撰写中不存在相关利益冲突。课题经费支持没有影响文章观点及对实验数据客观结果的统计分析及报道。
机构伦理问题：研究方案经江苏大学附属人民医院伦理委员会批准（伦审 2019-1217）。实验动物生产许可证号：SCXK（苏）2019-0006，实验动物使用许可证号：SYXK（苏）2019-0012。
