• 皖南医学院弋矶山医院创伤骨科(安徽芜湖  241001);
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目的 探讨 p22phox 和 NOX5 在缺氧诱导成骨细胞自噬和凋亡中的作用。方法 将新生大鼠颅骨组织剪碎,采用组织块贴壁法及差速贴壁法分离纯化成骨细胞。取第 1 代细胞行 HE、茜素红、ALP 染色以及流式细胞仪鉴定。采用三气培养箱制备成骨细胞缺氧模型,于缺氧 0、3、6、12、24 h 时,采用 Western blot 检测 p22phox、NOX5、LC3Ⅱ/Ⅰ表达情况,流式细胞仪检测活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)水平以及细胞凋亡率,选取细胞内 ROS 水平最高时间点作为后续实验的缺氧时间点。将第 1 代成骨细胞分成正常组、si-p22phox 缺氧处理组和 si-NOX5 缺氧处理组,行对应转染及缺氧处理后,采用 RT-PCR 检测 si-p22phox 和 si-NOX5 抑制效率。然后再将第1 代成骨细胞分成正常组、si-NC 缺氧处理组、si-p22phox 缺氧处理组以及 si-NOX5 缺氧处理组,行对应转染及缺氧处理后,采用 Western blot 检测细胞 p22phox、NOX5、自噬相关蛋白(LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin)、凋亡相关蛋白(Bcl-2、Bax)表达情况,流式细胞术检测细胞凋亡率和 ROS 水平。最后,将成骨细胞分成缺氧 12 h 组(缺氧组)和同时抑制 si-p22phox 及 si-NOX5 并缺氧 12 h 组(抑制+缺氧组),对应处理后免疫荧光染色观察 Beclin 及 Bax 表达。结果 经鉴定,分离获得的细胞为成骨细胞。缺氧处理后,成骨细胞 p22phox、NOX5、LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白相对表达量以及细胞凋亡率均逐渐升高(P<0.05),ROS 水平亦升高(P<0.05)且 12 h 达峰值;选择缺氧 12 h 模型进行后续实验。抑制 p22phox 基因不影响 NOX5 的表达,而抑制 NOX5 基因也不影响 p22phox 的表达;与单纯缺氧处理相比,抑制 p22phox 或 NOX5 基因表达后 LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin、Bax 蛋白相对表达量下降(P<0.05),Bcl-2 蛋白相对表达量增高(P<0.05),细胞凋亡率及 ROS 水平亦下降(P<0.05);同时抑制 p22phox 和 NOX5 基因表达后,免疫荧光染色见 Beclin、Bax 荧光较弱。结论 抑制 p22phox 和 NOX5 基因表达可以降低缺氧条件下成骨细胞内 ROS 水平,同时降低细胞自噬以及凋亡,尤其减弱了细胞早期向晚期凋亡的过渡,增强了缺氧成骨细胞的增殖能力。

引用本文: 何鹏杰, 李杨, 张若天, 任茂贤, 刘和栋, 杨民. p22phox 和 NOX5 在缺氧诱导成骨细胞自噬及凋亡中的作用研究. 中国修复重建外科杂志, 2021, 35(7): 855-861. doi: 10.7507/1002-1892.202008039 复制

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