儿童颅骨缺损修复是神经外科领域的世界性难题。临床上常见的颅骨修补材料无法满足儿童颅骨不断长大和变形的需求。理想的儿童颅骨修补材料应具有良好的诱导成骨能力，实现新骨再生和骨整合；具有匹配生长发育的可降解性能和顺应性，不限制正常骨骼生长；在修复过程中维持足够力学强度，保护颅内组织；易于塑形，满足美学需求。仿生矿化胶原骨材料是一种在微纳尺度上模拟天然骨最小结构单元的纳米复合材料，因其具有良好成骨活性而被成功应用于各种骨缺损修复。近年来，矿化胶原骨材料成功应用于颅骨再生修复，并取得了令人满意的修复效果。该综述重点介绍仿生矿化胶原纳米骨修复材料的基本特点，及其用于儿童颅骨缺损再生修复的优势及相关研究进展。
颅骨缺损是神经外科临床常见疾病。造成颅骨缺损的原因大多为后天获得性损伤，如意外事故造成的开放性缺失、颅骨病变（骨髓炎、骨肿瘤）以及治疗脑中风时采取的去骨瓣减压手术等；也可能是先天颅骨闭合不全、颅骨发育畸形。颅骨缺损如不及时修补，会引发颅骨缺损综合征甚至诱发脑损伤，严重威胁患者生命安全，导致心理疾病和社交障碍等[1-3]。值得一提的是，儿童头部意外损伤位于各种意外损伤之首，且将近半数病例为 3 岁以下婴幼儿[4]。
临床上对于直径超过 3 cm 的成人颅骨缺损，采用颅骨成形术进行治疗，即通过覆盖合适的修补材料来修补缺损，实现颅内部相对密闭，从而在生理上维持稳定颅内压，减轻颅骨缺损综合征，同时还可实现外观美容效果[2, 5-6]。这种治疗手段有较长发展历史，至今尚不完善，手术时机是影响治疗效果的重要因素之一。对于成人，在保证损伤恢复良好前提下，应适时接受颅骨成形术治疗[7-9]。而对于儿童，情况则更为复杂，儿童颅骨成形术的手术时机一直存在广泛争议。若即刻修补，术后可能会伴随感染、材料损坏、外围正常骨吸收、颅骨材料限制周围骨生长导致骨畸变，甚至颅脑损伤等风险；但若待患儿生长发育到一定年龄再进行手术，由于生长发育中大脑缺乏保护，很可能会导致脑萎缩、神经功能障碍等问题[1, 10-11]。因此，儿童颅骨缺损修复是神经外科领域的世界性难题，亟需有效的临床解决方案。
因此，本文综述了颅骨解剖学结构以及儿童颅骨生长发育的特点，将目前市场常用颅骨修复材料的性能进行了细致对比；结合本研究团队研发的具有成骨活性的仿生矿化胶原与可降解高分子材料构建的适用于颅骨再生修复的骨材料支架在生物体内的应用，分别制备了仿松质骨和密质骨系列骨材料，二者具有不同的降解速率和力学强度；同时，展望了 3D 打印技术在生物材料领域的突出特点，以及复合结构支架在颅骨修复中的潜在优势。
1 颅骨生长发育及损伤修复
1.1 颅骨的解剖学特点
人的大脑外侧主要由颅骨及其周围组织构成，自上而下包括头皮、颅骨以及脑膜[12]。颅骨由 23 块形状和大小不同的扁骨及不规则骨组成，除了下颌骨和舌骨以外，其余 21 块骨经由骨缝结合或者软骨结合形成一稳固整体，实现对颅内组织的保护作用。颅分为脑颅和面颅两部分，脑颅位于颅的后上部，包括成对的顶骨、颞骨，不成对的额骨、蝶骨、枕骨和筛骨共 8 块，承担着支撑起大脑所在空间、保护脑组织的关键任务；根据相对位置，又可将脑颅分解成两部分：颅底骨与颅盖骨。面颅为颅的前下部分，包含成对的上颌骨、颧骨、鼻骨、下颌骨、舌骨等 15 块，构成面部和五官的骨性支架。
颅盖骨分为 3 层，即外骨板、板障层以及内骨板。在颅盖骨与大脑之间的脑膜包括 3 层，自上而下依次是硬脑膜、蛛网膜以及软脑膜。硬脑膜顾名思义为 3 种软组织中最强韧的部分，在颅骨下方辅助保护大脑。蛛网膜为一层很薄的半透明结缔组织，其中几乎没有神经或血管；其下方存在较大空腔，称为蛛网膜下腔，其中充斥着脑脊液。软脑膜同样是薄且透明的一层膜，但其中含有丰富的微血管网络，是为大脑提供养分的重要途径之一。在颅盖骨与脑膜相邻的内侧，存在大量不规则沟槽结构，为硬脑膜上血管行走的痕迹，于人体发育过程中自然形成。
1.2 颅骨生长发育特点
颅骨生长发育在不同年龄阶段速度不同，相关量化指标包括颅腔内部容积、头围长度以及颅骨形状。多项研究采取 X 射线数据计算机重构数学模型的方式估算儿童颅腔容积[13]。印度一项相关研究[14]测量了 1 800 名印度 0～16 岁儿童及青少年的颅腔容积，结果表明，男婴刚出生时的平均颅腔容积为 370 mL，仅仅是印度成年男性平均值的 28%；而出生 6 个月的婴儿颅腔容积数值显著增加，男性和女性个体分别占成年后的 65% 和 59%；而 5 岁左右的儿童在正常发育前提下，颅腔容积可达最终大小的 80%。根据此项研究结果，儿童颅骨发育按照生长速度大体可分为 3 个时期。第 1 个为极快速增长期，对应阶段为出生后至 1 岁，颅腔容积呈现大幅度变化；第 2 个为快速增长期，对应阶段为 1 岁以后至 5、6 岁，颅腔容积快速持续增长；第 3 个为慢速增长期，对应阶段为 6 岁以后直至成熟，颅腔容积缓慢增长并最终趋于平稳。此外，儿童的头围增长变化也被用来评估颅骨生长速度。国内一项研究表明，处于快速增长期的儿童，每月头围生长速度在 1.2～1.3 cm[15]。此外，由于骨缝在 3 岁以下尚未闭合，颅骨的外形也时刻发生变化[16]。
1.3 颅骨缺损再生修复
颅骨的形成属于膜内成骨方式，骨形成过程没有软骨出现。首先由未分化的间充质细胞聚集、多层排列成膜状，这些细胞分泌松散的基质，其中含血管、成纤维细胞、骨前体细胞等；成骨细胞分化形成并分泌针状或岛状骨基质，骨基质随即钙化，成骨细胞覆盖在这些岛状骨基质表面并继续增加骨基质；被骨基质包埋的成骨细胞转变为骨细胞。最早出现成群的成骨细胞部位被称为骨化中心，原始的骨小梁从原发骨化中心向周围扩展。
骨损伤发生后，人体会启动相应生理机制实现对缺损处的修复再生。颅骨再生修复路径主要有 3 个：骨膜成骨、板障层成骨、硬脑膜成骨[17-18]。骨材料植入后，与这 3 种不同宿主组织发生接触，由其提供相应的血供和干细胞来源。其中，板障结构的松质骨有层间血管分布，能够提供组织再生的营养，同时有造血干细胞存在。而硬脑膜相较于板障层血供更加充足，且具有除造血干细胞以外的骨膜干细胞等 MSCs[19]，更有利于细胞募集以及向支架内部迁移。而外骨膜一侧干细胞源则较少，且损伤或手术时容易缺失。在骨材料支架引导下，颅骨重构主要依靠这 3 条途径实现新生组织的爬行替代。
2 颅骨成形术材料
2.1 临床常用颅骨修补材料
采用颅骨成形术重建颅骨时，填补材料对最终的修复效果起关键作用。从来源上分，颅骨成形术材料可以分为天然骨材料及其衍生产品和人工合成材料两大类。其中，自体骨是临床应用骨修复的“金标准”，自体骨和同种异体骨在各种骨科治疗中广泛应用。同样，对于颅骨缺损修复，可使用减压手术中取出的颅骨骨瓣或体内其他位置的健康扁骨。人工合成材料可分为金属类、无机非金属类以及有机高分子 3 大类[20-22]。钛及其合金在颅骨成形术中较常见，是制备医用型钛网的材料，其中使用较多的是 Ti-6Al-4V 合金。而无机非金属材料以具有生物活性的陶瓷类材料最为典型，包括纯羟基磷灰石材料、磷酸钙型骨水泥以及生物活性玻璃等[23-25]。近年来，有机高分子材料因其良好的生物相容性和与颅骨匹配的生物力学性能受到了越来越多的关注，如聚甲基丙烯酸甲酯（polymethyl methacrylate，PMMA）、聚醚醚酮（polyetheretherketone，PEEK）、多孔聚乙烯材料等[26-27]。
2.2 现有颅骨修补材料的不足
上述各种材料在应用于颅骨成形术时能够一定程度上满足要求，但也存在不容忽视的缺点，见表 1。并非所有患者都有自体骨瓣可用，且人体内很难找出与大尺寸颅骨缺损形状匹配的自体扁骨。有研究表明，对于面积超过 75 cm2的缺损，采用自体骨重构的失败率可达 60% 以上[28]。钛合金材料由于其弹性模量过高，可能导致严重周围骨吸收；射线的屏蔽作用也不利于患者影像学检查；此外还存在导热过高的问题[29-30]。PMMA 材料脆性较大，且不易与周围组织形成骨性结合。PEEK 材料造价较高、成型复杂，无明显成骨活性或者骨整合能力[31-32]。
表1
常用颅骨修补材料的优缺点
Table1.
Advantages and disadvantages of commonly used cranioplasty materials in clinic
2.3 儿童颅骨修补材料的特殊性和基本要求
上述临床常用颅骨修补材料应用于儿童颅骨缺损修补时问题更为突出。儿童自体骨来源更加有限，且取材会对儿童生长发育造成不可恢复的影响。而人工材料均不可降解，不可变形，无法匹配儿童颅骨不断长大和变形的需求。儿童颅骨成形术所用材料必须考虑儿童发育期的生长特点，不仅能满足暂时的填补和维持颅内稳定，同时应能够随儿童颅骨生长发育而产生变化[33-35]。因此，理想的儿童颅骨修补材料应以再生修复为出发点进行设计，植入材料作为组织再生支架，在体内能够促进颅骨再生，且实现再生与生长发育的平衡[36-38]。这类材料要满足以下基本要求：① 形状匹配，可通过适当工艺进行塑形，实现颅腔密闭、维持内压稳定、保证外表美观；② 在植入后及新骨形成前维持符合要求的机械性能，在整个修复周期内对颅脑组织起保护作用；③ 具有较好的新骨诱导能力，促进快速骨整合及骨再生；④ 适宜的降解能力，在完成初期支撑及干细胞募集作用后，逐渐被新生组织替代并最终完全降解；⑤ 具有射线穿透能力，不影响修复中的各种常规影像检测。
3 基于仿生矿化胶原骨材料的颅骨再生修复研究
3.1 组织工程策略修复颅骨缺损
组织工程和再生医学策略修复骨组织损伤已成功应用于临床。骨再生修复的核心是开发理想的生物材料支架，构建促进骨再生修复的微环境。组织工程支架材料不仅为缺损区提供结构支撑，同时还递送多种生物物理、生物化学信号，例如材料弹性模量、拓扑结构、无机离子、生长因子等，调控细胞的增殖、分化等生物学功能，激活组织再生潜能[39-41]。此外，还可以通过 3D 打印或模具塑形方式构建，能够与缺损区形状匹配，实现个性化定制，同时满足修复功能与美学要求[42-44]。例如，Kim 等[45]研发了一种 3D 打印的具有宏观/微光复合孔隙结构的磷酸镁陶瓷，并采用兔顶骨 6 mm 直径圆形缺损模型评价修复效果。结果显示支架发生了一定的体内生物降解，降解速率能通过孔径特征来调节，能够观察到新生骨组织长入；但是研究中缺乏对支架强度的评价，陶瓷材料具有较强脆性，难以保证颅内环境稳定。Yao 等[46]制备了聚己内酯/聚乳酸静电纺丝支架（具有高达 95.8% 的孔隙率，以模拟天然细胞外基质的作用），使用小鼠顶骨左侧 5 mm 直径圆形缺损模型评价修复效果。结果显示，支架中存在大量原位迁移的细胞并向骨细胞分化；但该材料的力学性能过低，抗压强度不足 0.2 MPa。Prananingrum 等[47]通过造孔方法改变了钛金属的微观结构，形成具有特定尺寸连通孔隙的支架，并将支架应用于新西兰白兔 5 mm 直径颅骨缺损模型，进行为期 5 个月的评价。结果表明，通过改善结构能够提升金属支架的骨亲和性，可以观察到骨组织长入；但钛金属造孔后仍具有较高弹性模量，且不具备明显降解性。此外，众多研究团队选择在机械强度、化学组成以及微观结构方面对骨组织进行模拟，来构建能够诱导骨再生的颅骨材料。值得一提的是，这些研究中针对发育期颅骨缺损修复的较少，均采用的是成年动物模型。
3.2 仿生矿化胶原骨材料修复颅骨缺损及相关机制
天然骨具有复杂的分级结构，其中最小结构单元为矿化胶原微纤维，由有序排列的胶原纤维模板以及在其特有化学位点结合的纳米羟基磷灰石晶体自组装而成。自组装的矿化胶原微纤维是天然骨组织形成的第二级结构[48-49]。清华大学崔福斋团队于 2003 年首次实现了矿化胶原的体外仿生合成[50-53]。仿生矿化胶原与天然矿化胶原相比，不仅具有一致的化学组成，还在微纳结构上具有极高相似性。多年来，大量关于仿生矿化胶原的研究证明了其具有优异的骨相容性以及成骨诱导能力。以仿生矿化胶原为主要活性成分的多种骨修复产品已广泛应用于临床，并取得了良好修复效果[54-55]。
组成仿生矿化胶原骨材料的纳米羟基磷灰石和胶原蛋白对成骨均具有良好促进作用。钙磷体系作为人骨组成成分，可对干细胞的成骨分化起到调节作用[56-58]。许多研究显示，钙磷体系材料不仅能提高包括骨肉瘤细胞、人 BMSCs 在内的多种骨相关细胞的黏附与增殖，还能通过钙磷离子释放改变细胞微环境成分、氢离子浓度指数等实现对细胞成骨分化的调节[59-63]。已有研究表明，仿生矿化胶原能够显著促进 MSCs 的成骨分化，激活相关信号通路，调节成骨相关基因表达。其中，TGF-β、BMP 两种信号在胚胎骨形成以及骨平衡的维持中起到基础性作用。二者所启动的是经典 Smad 蛋白依赖型信号通路以及非经典的 p38 激酶依赖型信号通路，两条信号通路最后都是通过开启 Runt 相关转录因子 2（Runt-related transcription factor 2，Runx2），进而实现前体细胞向成骨细胞或成软骨细胞分化。有研究者通过人 BMSCs 体外培养，对比了仿生矿化胶原与纳米羟基磷灰石促进成骨分化的效果。结果表明仿生矿化胶原能够通过调节成骨细胞相关基因表达，诱导干细胞成骨分化[52-53]。相比于化学组成相近的纳米羟基磷灰石，仿生矿化胶原特有的微纳复合结构能够诱导基因的更高表达。
3.3 仿生矿化胶原颅骨修复体用于颅骨损伤再生修复
近几年，具有成骨诱导性骨材料的开发是骨组织研究重点。越来越多骨材料被用于颅骨再生修复，或采用颅骨损伤模型评价其成骨能力[64-66]。例如，Kim 等[45]研发了一种具有多孔结构的磷酸镁陶瓷支架，该支架使用 3D 打印技术制备，且具有宏观/微观孔隙复合结构；兔颅骨顶部缺损模型评价结果表明，支架具有一定降解能力，同时能够促进更多新生骨组织长入。Shao 等[67]设计制备了一种镁掺杂硅酸钙生物陶瓷，具有良好的抗压强度和抗弯强度；在兔颅骨直径 8 mm 缺损修复中显示出良好的骨整合能力，大量新生骨组织进入支架间隙中，且材料能够实现很好的支撑作用。但该材料体系降解速度慢，新生骨不是置换型再生，而是在材料孔隙间形成。Cui 等[68]和 Tang 等[69]研究表明，支架的力学性能和孔隙特点与其成骨能力具有密切相关性。除了生物陶瓷材料外，近年来高性能的高分子材料和水凝胶材料也被用于骨再生修复[70]。尽管当前颅骨再生修复的研究很多，但关注发育期儿童颅骨缺损修复，特别是对大面积颅骨缺损的研究较少。而对于临床颅骨缺损而言，其面积往往在 70 cm2 以上，有时甚至会超过 100 cm2，这对诱导再生的骨材料力学稳定性提出了更高要求。
本研究团队采用具有成骨活性的仿生矿化胶原与可降解高分子材料构建了适用于颅骨再生修复的骨材料支架。通过不同成型工艺和孔隙调控制备了仿松质骨和仿密质骨的系列骨材料，具有不同的降解速率和力学强度[71]。仿松质骨的多孔骨材料微观形貌为典型的连通孔结构，抗压强度与天然松质骨相当。体外细胞相容性评价表明，成骨相关细胞（如 MC3T3-E1 细胞、人 MSCs 细胞）在材料表面处于良好黏附状态，细胞均能正常增殖，显示出骨材料良好的生物相容性。此外，仿生矿化胶原骨材料能够促使 BMP-2 和 Runx2 两种成骨相关基因高表达，同时也能检测到骨细胞形成过程中的关键基因（Ⅰ型胶原和骨桥蛋白）表达活跃[71]。
多孔矿化胶原骨材料的孔径特性对其在颅骨再生的修复中发挥着重要作用。支架材料的孔径大小和孔隙率可通过溶剂含量调节，孔径和孔隙率的增大更有利于支架内部营养交换和新陈代谢过程，有助于周围骨组织长入；但同时材料强度明显下降。由于颅骨修复支架要保障颅骨损伤区的结构稳定性和支撑保护作用，因此合适的颅骨修补材料要具有适宜的孔径特性，达到再生修复和结构支撑相协调。本团队采用大鼠颅骨缺损模型评价了不同孔径分布特性的多孔骨材料，结果表明，尽管各组多孔材料均能诱导新骨组织再生，但其再生效率和修复结果却有明显差异。随着孔径增大，再生骨量出现了逐渐增大又下降的趋势；孔径分布为 20～100 μm 的骨支架具有最大成骨面积、最厚骨桥厚度以及最大定量化成骨体积；而当孔径进一步增大时，支架力学强度出现明显下降，骨再生效率也随之下降。说明颅骨再生修复材料存在着材料降解与组织修复之间的平衡，也存在着力学强度和组织修复之间的平衡[71]。
优化的仿松质骨多孔骨材料虽然具有良好成骨诱导能力，但其力学性能仍不能满足临床上大面积颅骨缺损需求。颅骨很薄，但损伤面积往往很大，因此薄板样的多孔骨材料显然不能满足植入时的力学性能要求，更难抵抗高颅内压，难以保证整个修复周期过程中颅脑内环境相对稳定。因此，本团队研发了仿密质骨的高强骨材料，具有接近皮质骨量级的强度。在成年小尾寒羊颅骨缺损修复过程中，仿密质骨高强骨材料表现出了优秀的骨整合能力和一定成骨诱导能力。植入后 6 个月 CT 三维重建和组织学评价结果显示，骨材料与周围骨之间充分融合，优于作为对照组的 PMMA 和钛网。材料未发生明显降解，但与外围骨形成了骨性结合，在其下方与硬脑膜之间也观察到明显新骨形成。可见，该材料能够提供充分的力学保护，在骨融合前不发生明显降解和碎裂，起到稳定颅内环境的作用[72]。
儿童颅骨缺损修复具有和成年颅骨缺损修复不同的特殊性，除了要考虑再生能力和力学保护作用，还要求骨材料能够匹配发育中颅骨的生长变化需求。本团队研究中，根据羊的生长特征构建了 1 月龄小尾寒羊大尺寸（直径 3 cm）颅骨缺损模型，能够在一定程度上模拟 2～3 岁处于快速生长期儿童的颅骨变化。影像学检查结果表明，1 月龄羊颅骨尺寸在术后 3 个月期间明显增大。采用仿松质骨多孔骨材料的实验组从术后不显影状态，转变为术后 3 个月的高骨密度状态；仿密质骨高强骨材料实验组与外围骨之间发生明显融合，边界变得模糊，X 射线不显影。样本的新鲜断面显示，仿松质骨材料已基本降解，被新生组织替代，且与周围骨组织充分融合，无法辨识边界和材料轮廓，表明通过板障层成骨路径成骨显著；而仿密质骨高强骨材料形态完整，但与外围骨组织充分融合，且无宏观裂痕，材料底部有明显新生骨组织，表明其能够通过诱导硬脑膜成骨路径促进新骨再生。上述结果表明，多孔骨材料的诱导再生效率能够匹配其自身降解速率，新组织形成与材料降解同步进行；致密型骨材料维持初始力学强度的时间与骨融合形成时间匹配，牢固结合的同时维持自身完整性。此外，1 月龄羊颅骨在明显长大过程中，会受到来自植入材料的影响。传统钛板具有明显限制作用，出现了十分严重的周围颅骨畸变。而仿生矿化胶原骨材料未出现这一问题，多孔骨材料因可随骨长入而逐渐降解，势必会协同修复和生长过程；而高强骨材料的力学性能和天然颅骨相适应，展示出非常好的顺应性，能够促进骨融合同时并未限制骨生长[73]。因此，本团队开发了仿松质骨/仿密质骨双相复合结构颅骨修复体，多孔骨材料部分快速诱导骨长入，高强骨材料部分提供初始支撑强度。初步研究结果表明，该复合结构颅骨修复体具有理想的颅骨再生修复效果，同时对颅脑的保护作用增强。有关双相复合结构的设计优化及对颅骨生长/再生的影响正在进一步研究中。
4 小结与展望
儿童颅骨缺损修复一直是世界性难题，特别是关于儿童颅骨成形术的手术时机争议不断。但不可否认的是，儿童具有很强的颅骨再生修复能力，是颅骨再生修复的黄金时期。而且，颅骨缺损若不修补，对儿童生理、心理健康都不利。目前，不建议儿童进行颅骨修补的原因主要是现有颅骨修补材料会限制颅骨生长，造成颅骨畸变和颅脑损伤。可见，有关儿童颅骨成形术的争议焦点在于颅骨修补材料。因此，开发出不限制颅骨生长或能促进颅骨再生修复的修补材料，是儿童颅骨成形术的重中之重。
传统颅骨成形术材料更偏向于形状修补，几乎不具有诱导组织再生潜力，同时材料也多不降解。开发理想修补材料的关键在于生长发育和再生修复、结构支撑之间的平衡。仿生矿化胶原骨材料以颅骨的再生修复为出发点，构建了较为适宜的发育期颅骨再生修复微环境，通过调整材料制备工艺以满足修复中的不同需求。从仿生学角度出发，在微纳米结构上矿化胶原微纤维是天然骨的最微小结构单元，成分和微观结构都起到刺激细胞的调控信号作用。仿松质骨材料的微米多孔结构提供了细胞迁移、营养物质以及废物代谢的物理空间，力学强度与天然松质骨相仿，并且会伴随组织再生发生降解。而仿密质骨材料则考虑到修复过程中对支架本身力学强度的要求，能够在不限制外围骨生长前提下，快速实现与外围骨的融合，并且在足够长时间内保持材料自身完整性，维持颅内环境相对稳定。尽管两种类型矿化胶原骨材料在匹配组织再生降解和维持修复过程稳定两方面均表现出了适宜性能，但对于发育期大尺寸颅骨缺损修复而言，这两方面需要兼而有之。因此，设计仿松质骨/仿密质骨两相复合结构的矿化胶原骨材料，能够结合二者优点，实现更为良好的修复效果。但复合结构的图案化设计值得深入研究，应在保障足够力学支撑前提下实现骨再生最大化。
颅骨缺损修复不同于其他骨骼，往往缺损形状不规则，且要满足美学需求，需要具备和患者颅脑轮廓一致的结构，因此对颅骨修补材料提出了更高要求。3D 打印技术为实现颅骨修补材料的个性化制备提供了可能。对于仿生矿化胶原骨材料，开发新的 3D 打印技术能够实现多孔和致密骨材料的打印，保证矿化胶原的稳定性和生物活性，以及骨材料的强度，是当前研究的重点。
作者贡献：李博负责撰稿、文章逻辑、技术数段；王硕负责撰稿、文章逻辑；赵勇刚负责撰稿、校稿、图片处理；王秀梅负责实验经费、实验思路、文章构架、撰稿。
利益冲突：所有作者声明，在课题研究和文章撰写过程中不存在利益冲突。经费支持未影响文章观点。
颅骨缺损是神经外科临床常见疾病。造成颅骨缺损的原因大多为后天获得性损伤，如意外事故造成的开放性缺失、颅骨病变（骨髓炎、骨肿瘤）以及治疗脑中风时采取的去骨瓣减压手术等；也可能是先天颅骨闭合不全、颅骨发育畸形。颅骨缺损如不及时修补，会引发颅骨缺损综合征甚至诱发脑损伤，严重威胁患者生命安全，导致心理疾病和社交障碍等[1-3]。值得一提的是，儿童头部意外损伤位于各种意外损伤之首，且将近半数病例为 3 岁以下婴幼儿[4]。
临床上对于直径超过 3 cm 的成人颅骨缺损，采用颅骨成形术进行治疗，即通过覆盖合适的修补材料来修补缺损，实现颅内部相对密闭，从而在生理上维持稳定颅内压，减轻颅骨缺损综合征，同时还可实现外观美容效果[2, 5-6]。这种治疗手段有较长发展历史，至今尚不完善，手术时机是影响治疗效果的重要因素之一。对于成人，在保证损伤恢复良好前提下，应适时接受颅骨成形术治疗[7-9]。而对于儿童，情况则更为复杂，儿童颅骨成形术的手术时机一直存在广泛争议。若即刻修补，术后可能会伴随感染、材料损坏、外围正常骨吸收、颅骨材料限制周围骨生长导致骨畸变，甚至颅脑损伤等风险；但若待患儿生长发育到一定年龄再进行手术，由于生长发育中大脑缺乏保护，很可能会导致脑萎缩、神经功能障碍等问题[1, 10-11]。因此，儿童颅骨缺损修复是神经外科领域的世界性难题，亟需有效的临床解决方案。
因此，本文综述了颅骨解剖学结构以及儿童颅骨生长发育的特点，将目前市场常用颅骨修复材料的性能进行了细致对比；结合本研究团队研发的具有成骨活性的仿生矿化胶原与可降解高分子材料构建的适用于颅骨再生修复的骨材料支架在生物体内的应用，分别制备了仿松质骨和密质骨系列骨材料，二者具有不同的降解速率和力学强度；同时，展望了 3D 打印技术在生物材料领域的突出特点，以及复合结构支架在颅骨修复中的潜在优势。
1 颅骨生长发育及损伤修复
1.1 颅骨的解剖学特点
人的大脑外侧主要由颅骨及其周围组织构成，自上而下包括头皮、颅骨以及脑膜[12]。颅骨由 23 块形状和大小不同的扁骨及不规则骨组成，除了下颌骨和舌骨以外，其余 21 块骨经由骨缝结合或者软骨结合形成一稳固整体，实现对颅内组织的保护作用。颅分为脑颅和面颅两部分，脑颅位于颅的后上部，包括成对的顶骨、颞骨，不成对的额骨、蝶骨、枕骨和筛骨共 8 块，承担着支撑起大脑所在空间、保护脑组织的关键任务；根据相对位置，又可将脑颅分解成两部分：颅底骨与颅盖骨。面颅为颅的前下部分，包含成对的上颌骨、颧骨、鼻骨、下颌骨、舌骨等 15 块，构成面部和五官的骨性支架。
颅盖骨分为 3 层，即外骨板、板障层以及内骨板。在颅盖骨与大脑之间的脑膜包括 3 层，自上而下依次是硬脑膜、蛛网膜以及软脑膜。硬脑膜顾名思义为 3 种软组织中最强韧的部分，在颅骨下方辅助保护大脑。蛛网膜为一层很薄的半透明结缔组织，其中几乎没有神经或血管；其下方存在较大空腔，称为蛛网膜下腔，其中充斥着脑脊液。软脑膜同样是薄且透明的一层膜，但其中含有丰富的微血管网络，是为大脑提供养分的重要途径之一。在颅盖骨与脑膜相邻的内侧，存在大量不规则沟槽结构，为硬脑膜上血管行走的痕迹，于人体发育过程中自然形成。
1.2 颅骨生长发育特点
颅骨生长发育在不同年龄阶段速度不同，相关量化指标包括颅腔内部容积、头围长度以及颅骨形状。多项研究采取 X 射线数据计算机重构数学模型的方式估算儿童颅腔容积[13]。印度一项相关研究[14]测量了 1 800 名印度 0～16 岁儿童及青少年的颅腔容积，结果表明，男婴刚出生时的平均颅腔容积为 370 mL，仅仅是印度成年男性平均值的 28%；而出生 6 个月的婴儿颅腔容积数值显著增加，男性和女性个体分别占成年后的 65% 和 59%；而 5 岁左右的儿童在正常发育前提下，颅腔容积可达最终大小的 80%。根据此项研究结果，儿童颅骨发育按照生长速度大体可分为 3 个时期。第 1 个为极快速增长期，对应阶段为出生后至 1 岁，颅腔容积呈现大幅度变化；第 2 个为快速增长期，对应阶段为 1 岁以后至 5、6 岁，颅腔容积快速持续增长；第 3 个为慢速增长期，对应阶段为 6 岁以后直至成熟，颅腔容积缓慢增长并最终趋于平稳。此外，儿童的头围增长变化也被用来评估颅骨生长速度。国内一项研究表明，处于快速增长期的儿童，每月头围生长速度在 1.2～1.3 cm[15]。此外，由于骨缝在 3 岁以下尚未闭合，颅骨的外形也时刻发生变化[16]。
1.3 颅骨缺损再生修复
颅骨的形成属于膜内成骨方式，骨形成过程没有软骨出现。首先由未分化的间充质细胞聚集、多层排列成膜状，这些细胞分泌松散的基质，其中含血管、成纤维细胞、骨前体细胞等；成骨细胞分化形成并分泌针状或岛状骨基质，骨基质随即钙化，成骨细胞覆盖在这些岛状骨基质表面并继续增加骨基质；被骨基质包埋的成骨细胞转变为骨细胞。最早出现成群的成骨细胞部位被称为骨化中心，原始的骨小梁从原发骨化中心向周围扩展。
骨损伤发生后，人体会启动相应生理机制实现对缺损处的修复再生。颅骨再生修复路径主要有 3 个：骨膜成骨、板障层成骨、硬脑膜成骨[17-18]。骨材料植入后，与这 3 种不同宿主组织发生接触，由其提供相应的血供和干细胞来源。其中，板障结构的松质骨有层间血管分布，能够提供组织再生的营养，同时有造血干细胞存在。而硬脑膜相较于板障层血供更加充足，且具有除造血干细胞以外的骨膜干细胞等 MSCs[19]，更有利于细胞募集以及向支架内部迁移。而外骨膜一侧干细胞源则较少，且损伤或手术时容易缺失。在骨材料支架引导下，颅骨重构主要依靠这 3 条途径实现新生组织的爬行替代。
2 颅骨成形术材料
2.1 临床常用颅骨修补材料
采用颅骨成形术重建颅骨时，填补材料对最终的修复效果起关键作用。从来源上分，颅骨成形术材料可以分为天然骨材料及其衍生产品和人工合成材料两大类。其中，自体骨是临床应用骨修复的“金标准”，自体骨和同种异体骨在各种骨科治疗中广泛应用。同样，对于颅骨缺损修复，可使用减压手术中取出的颅骨骨瓣或体内其他位置的健康扁骨。人工合成材料可分为金属类、无机非金属类以及有机高分子 3 大类[20-22]。钛及其合金在颅骨成形术中较常见，是制备医用型钛网的材料，其中使用较多的是 Ti-6Al-4V 合金。而无机非金属材料以具有生物活性的陶瓷类材料最为典型，包括纯羟基磷灰石材料、磷酸钙型骨水泥以及生物活性玻璃等[23-25]。近年来，有机高分子材料因其良好的生物相容性和与颅骨匹配的生物力学性能受到了越来越多的关注，如聚甲基丙烯酸甲酯（polymethyl methacrylate，PMMA）、聚醚醚酮（polyetheretherketone，PEEK）、多孔聚乙烯材料等[26-27]。
2.2 现有颅骨修补材料的不足
上述各种材料在应用于颅骨成形术时能够一定程度上满足要求，但也存在不容忽视的缺点，见表 1。并非所有患者都有自体骨瓣可用，且人体内很难找出与大尺寸颅骨缺损形状匹配的自体扁骨。有研究表明，对于面积超过 75 cm2的缺损，采用自体骨重构的失败率可达 60% 以上[28]。钛合金材料由于其弹性模量过高，可能导致严重周围骨吸收；射线的屏蔽作用也不利于患者影像学检查；此外还存在导热过高的问题[29-30]。PMMA 材料脆性较大，且不易与周围组织形成骨性结合。PEEK 材料造价较高、成型复杂，无明显成骨活性或者骨整合能力[31-32]。
表1
常用颅骨修补材料的优缺点
Table1.
Advantages and disadvantages of commonly used cranioplasty materials in clinic
2.3 儿童颅骨修补材料的特殊性和基本要求
上述临床常用颅骨修补材料应用于儿童颅骨缺损修补时问题更为突出。儿童自体骨来源更加有限，且取材会对儿童生长发育造成不可恢复的影响。而人工材料均不可降解，不可变形，无法匹配儿童颅骨不断长大和变形的需求。儿童颅骨成形术所用材料必须考虑儿童发育期的生长特点，不仅能满足暂时的填补和维持颅内稳定，同时应能够随儿童颅骨生长发育而产生变化[33-35]。因此，理想的儿童颅骨修补材料应以再生修复为出发点进行设计，植入材料作为组织再生支架，在体内能够促进颅骨再生，且实现再生与生长发育的平衡[36-38]。这类材料要满足以下基本要求：① 形状匹配，可通过适当工艺进行塑形，实现颅腔密闭、维持内压稳定、保证外表美观；② 在植入后及新骨形成前维持符合要求的机械性能，在整个修复周期内对颅脑组织起保护作用；③ 具有较好的新骨诱导能力，促进快速骨整合及骨再生；④ 适宜的降解能力，在完成初期支撑及干细胞募集作用后，逐渐被新生组织替代并最终完全降解；⑤ 具有射线穿透能力，不影响修复中的各种常规影像检测。
3 基于仿生矿化胶原骨材料的颅骨再生修复研究
3.1 组织工程策略修复颅骨缺损
组织工程和再生医学策略修复骨组织损伤已成功应用于临床。骨再生修复的核心是开发理想的生物材料支架，构建促进骨再生修复的微环境。组织工程支架材料不仅为缺损区提供结构支撑，同时还递送多种生物物理、生物化学信号，例如材料弹性模量、拓扑结构、无机离子、生长因子等，调控细胞的增殖、分化等生物学功能，激活组织再生潜能[39-41]。此外，还可以通过 3D 打印或模具塑形方式构建，能够与缺损区形状匹配，实现个性化定制，同时满足修复功能与美学要求[42-44]。例如，Kim 等[45]研发了一种 3D 打印的具有宏观/微光复合孔隙结构的磷酸镁陶瓷，并采用兔顶骨 6 mm 直径圆形缺损模型评价修复效果。结果显示支架发生了一定的体内生物降解，降解速率能通过孔径特征来调节，能够观察到新生骨组织长入；但是研究中缺乏对支架强度的评价，陶瓷材料具有较强脆性，难以保证颅内环境稳定。Yao 等[46]制备了聚己内酯/聚乳酸静电纺丝支架（具有高达 95.8% 的孔隙率，以模拟天然细胞外基质的作用），使用小鼠顶骨左侧 5 mm 直径圆形缺损模型评价修复效果。结果显示，支架中存在大量原位迁移的细胞并向骨细胞分化；但该材料的力学性能过低，抗压强度不足 0.2 MPa。Prananingrum 等[47]通过造孔方法改变了钛金属的微观结构，形成具有特定尺寸连通孔隙的支架，并将支架应用于新西兰白兔 5 mm 直径颅骨缺损模型，进行为期 5 个月的评价。结果表明，通过改善结构能够提升金属支架的骨亲和性，可以观察到骨组织长入；但钛金属造孔后仍具有较高弹性模量，且不具备明显降解性。此外，众多研究团队选择在机械强度、化学组成以及微观结构方面对骨组织进行模拟，来构建能够诱导骨再生的颅骨材料。值得一提的是，这些研究中针对发育期颅骨缺损修复的较少，均采用的是成年动物模型。
3.2 仿生矿化胶原骨材料修复颅骨缺损及相关机制
天然骨具有复杂的分级结构，其中最小结构单元为矿化胶原微纤维，由有序排列的胶原纤维模板以及在其特有化学位点结合的纳米羟基磷灰石晶体自组装而成。自组装的矿化胶原微纤维是天然骨组织形成的第二级结构[48-49]。清华大学崔福斋团队于 2003 年首次实现了矿化胶原的体外仿生合成[50-53]。仿生矿化胶原与天然矿化胶原相比，不仅具有一致的化学组成，还在微纳结构上具有极高相似性。多年来，大量关于仿生矿化胶原的研究证明了其具有优异的骨相容性以及成骨诱导能力。以仿生矿化胶原为主要活性成分的多种骨修复产品已广泛应用于临床，并取得了良好修复效果[54-55]。
组成仿生矿化胶原骨材料的纳米羟基磷灰石和胶原蛋白对成骨均具有良好促进作用。钙磷体系作为人骨组成成分，可对干细胞的成骨分化起到调节作用[56-58]。许多研究显示，钙磷体系材料不仅能提高包括骨肉瘤细胞、人 BMSCs 在内的多种骨相关细胞的黏附与增殖，还能通过钙磷离子释放改变细胞微环境成分、氢离子浓度指数等实现对细胞成骨分化的调节[59-63]。已有研究表明，仿生矿化胶原能够显著促进 MSCs 的成骨分化，激活相关信号通路，调节成骨相关基因表达。其中，TGF-β、BMP 两种信号在胚胎骨形成以及骨平衡的维持中起到基础性作用。二者所启动的是经典 Smad 蛋白依赖型信号通路以及非经典的 p38 激酶依赖型信号通路，两条信号通路最后都是通过开启 Runt 相关转录因子 2（Runt-related transcription factor 2，Runx2），进而实现前体细胞向成骨细胞或成软骨细胞分化。有研究者通过人 BMSCs 体外培养，对比了仿生矿化胶原与纳米羟基磷灰石促进成骨分化的效果。结果表明仿生矿化胶原能够通过调节成骨细胞相关基因表达，诱导干细胞成骨分化[52-53]。相比于化学组成相近的纳米羟基磷灰石，仿生矿化胶原特有的微纳复合结构能够诱导基因的更高表达。
3.3 仿生矿化胶原颅骨修复体用于颅骨损伤再生修复
近几年，具有成骨诱导性骨材料的开发是骨组织研究重点。越来越多骨材料被用于颅骨再生修复，或采用颅骨损伤模型评价其成骨能力[64-66]。例如，Kim 等[45]研发了一种具有多孔结构的磷酸镁陶瓷支架，该支架使用 3D 打印技术制备，且具有宏观/微观孔隙复合结构；兔颅骨顶部缺损模型评价结果表明，支架具有一定降解能力，同时能够促进更多新生骨组织长入。Shao 等[67]设计制备了一种镁掺杂硅酸钙生物陶瓷，具有良好的抗压强度和抗弯强度；在兔颅骨直径 8 mm 缺损修复中显示出良好的骨整合能力，大量新生骨组织进入支架间隙中，且材料能够实现很好的支撑作用。但该材料体系降解速度慢，新生骨不是置换型再生，而是在材料孔隙间形成。Cui 等[68]和 Tang 等[69]研究表明，支架的力学性能和孔隙特点与其成骨能力具有密切相关性。除了生物陶瓷材料外，近年来高性能的高分子材料和水凝胶材料也被用于骨再生修复[70]。尽管当前颅骨再生修复的研究很多，但关注发育期儿童颅骨缺损修复，特别是对大面积颅骨缺损的研究较少。而对于临床颅骨缺损而言，其面积往往在 70 cm2 以上，有时甚至会超过 100 cm2，这对诱导再生的骨材料力学稳定性提出了更高要求。
本研究团队采用具有成骨活性的仿生矿化胶原与可降解高分子材料构建了适用于颅骨再生修复的骨材料支架。通过不同成型工艺和孔隙调控制备了仿松质骨和仿密质骨的系列骨材料，具有不同的降解速率和力学强度[71]。仿松质骨的多孔骨材料微观形貌为典型的连通孔结构，抗压强度与天然松质骨相当。体外细胞相容性评价表明，成骨相关细胞（如 MC3T3-E1 细胞、人 MSCs 细胞）在材料表面处于良好黏附状态，细胞均能正常增殖，显示出骨材料良好的生物相容性。此外，仿生矿化胶原骨材料能够促使 BMP-2 和 Runx2 两种成骨相关基因高表达，同时也能检测到骨细胞形成过程中的关键基因（Ⅰ型胶原和骨桥蛋白）表达活跃[71]。
多孔矿化胶原骨材料的孔径特性对其在颅骨再生的修复中发挥着重要作用。支架材料的孔径大小和孔隙率可通过溶剂含量调节，孔径和孔隙率的增大更有利于支架内部营养交换和新陈代谢过程，有助于周围骨组织长入；但同时材料强度明显下降。由于颅骨修复支架要保障颅骨损伤区的结构稳定性和支撑保护作用，因此合适的颅骨修补材料要具有适宜的孔径特性，达到再生修复和结构支撑相协调。本团队采用大鼠颅骨缺损模型评价了不同孔径分布特性的多孔骨材料，结果表明，尽管各组多孔材料均能诱导新骨组织再生，但其再生效率和修复结果却有明显差异。随着孔径增大，再生骨量出现了逐渐增大又下降的趋势；孔径分布为 20～100 μm 的骨支架具有最大成骨面积、最厚骨桥厚度以及最大定量化成骨体积；而当孔径进一步增大时，支架力学强度出现明显下降，骨再生效率也随之下降。说明颅骨再生修复材料存在着材料降解与组织修复之间的平衡，也存在着力学强度和组织修复之间的平衡[71]。
优化的仿松质骨多孔骨材料虽然具有良好成骨诱导能力，但其力学性能仍不能满足临床上大面积颅骨缺损需求。颅骨很薄，但损伤面积往往很大，因此薄板样的多孔骨材料显然不能满足植入时的力学性能要求，更难抵抗高颅内压，难以保证整个修复周期过程中颅脑内环境相对稳定。因此，本团队研发了仿密质骨的高强骨材料，具有接近皮质骨量级的强度。在成年小尾寒羊颅骨缺损修复过程中，仿密质骨高强骨材料表现出了优秀的骨整合能力和一定成骨诱导能力。植入后 6 个月 CT 三维重建和组织学评价结果显示，骨材料与周围骨之间充分融合，优于作为对照组的 PMMA 和钛网。材料未发生明显降解，但与外围骨形成了骨性结合，在其下方与硬脑膜之间也观察到明显新骨形成。可见，该材料能够提供充分的力学保护，在骨融合前不发生明显降解和碎裂，起到稳定颅内环境的作用[72]。
儿童颅骨缺损修复具有和成年颅骨缺损修复不同的特殊性，除了要考虑再生能力和力学保护作用，还要求骨材料能够匹配发育中颅骨的生长变化需求。本团队研究中，根据羊的生长特征构建了 1 月龄小尾寒羊大尺寸（直径 3 cm）颅骨缺损模型，能够在一定程度上模拟 2～3 岁处于快速生长期儿童的颅骨变化。影像学检查结果表明，1 月龄羊颅骨尺寸在术后 3 个月期间明显增大。采用仿松质骨多孔骨材料的实验组从术后不显影状态，转变为术后 3 个月的高骨密度状态；仿密质骨高强骨材料实验组与外围骨之间发生明显融合，边界变得模糊，X 射线不显影。样本的新鲜断面显示，仿松质骨材料已基本降解，被新生组织替代，且与周围骨组织充分融合，无法辨识边界和材料轮廓，表明通过板障层成骨路径成骨显著；而仿密质骨高强骨材料形态完整，但与外围骨组织充分融合，且无宏观裂痕，材料底部有明显新生骨组织，表明其能够通过诱导硬脑膜成骨路径促进新骨再生。上述结果表明，多孔骨材料的诱导再生效率能够匹配其自身降解速率，新组织形成与材料降解同步进行；致密型骨材料维持初始力学强度的时间与骨融合形成时间匹配，牢固结合的同时维持自身完整性。此外，1 月龄羊颅骨在明显长大过程中，会受到来自植入材料的影响。传统钛板具有明显限制作用，出现了十分严重的周围颅骨畸变。而仿生矿化胶原骨材料未出现这一问题，多孔骨材料因可随骨长入而逐渐降解，势必会协同修复和生长过程；而高强骨材料的力学性能和天然颅骨相适应，展示出非常好的顺应性，能够促进骨融合同时并未限制骨生长[73]。因此，本团队开发了仿松质骨/仿密质骨双相复合结构颅骨修复体，多孔骨材料部分快速诱导骨长入，高强骨材料部分提供初始支撑强度。初步研究结果表明，该复合结构颅骨修复体具有理想的颅骨再生修复效果，同时对颅脑的保护作用增强。有关双相复合结构的设计优化及对颅骨生长/再生的影响正在进一步研究中。
4 小结与展望
儿童颅骨缺损修复一直是世界性难题，特别是关于儿童颅骨成形术的手术时机争议不断。但不可否认的是，儿童具有很强的颅骨再生修复能力，是颅骨再生修复的黄金时期。而且，颅骨缺损若不修补，对儿童生理、心理健康都不利。目前，不建议儿童进行颅骨修补的原因主要是现有颅骨修补材料会限制颅骨生长，造成颅骨畸变和颅脑损伤。可见，有关儿童颅骨成形术的争议焦点在于颅骨修补材料。因此，开发出不限制颅骨生长或能促进颅骨再生修复的修补材料，是儿童颅骨成形术的重中之重。
传统颅骨成形术材料更偏向于形状修补，几乎不具有诱导组织再生潜力，同时材料也多不降解。开发理想修补材料的关键在于生长发育和再生修复、结构支撑之间的平衡。仿生矿化胶原骨材料以颅骨的再生修复为出发点，构建了较为适宜的发育期颅骨再生修复微环境，通过调整材料制备工艺以满足修复中的不同需求。从仿生学角度出发，在微纳米结构上矿化胶原微纤维是天然骨的最微小结构单元，成分和微观结构都起到刺激细胞的调控信号作用。仿松质骨材料的微米多孔结构提供了细胞迁移、营养物质以及废物代谢的物理空间，力学强度与天然松质骨相仿，并且会伴随组织再生发生降解。而仿密质骨材料则考虑到修复过程中对支架本身力学强度的要求，能够在不限制外围骨生长前提下，快速实现与外围骨的融合，并且在足够长时间内保持材料自身完整性，维持颅内环境相对稳定。尽管两种类型矿化胶原骨材料在匹配组织再生降解和维持修复过程稳定两方面均表现出了适宜性能，但对于发育期大尺寸颅骨缺损修复而言，这两方面需要兼而有之。因此，设计仿松质骨/仿密质骨两相复合结构的矿化胶原骨材料，能够结合二者优点，实现更为良好的修复效果。但复合结构的图案化设计值得深入研究，应在保障足够力学支撑前提下实现骨再生最大化。
颅骨缺损修复不同于其他骨骼，往往缺损形状不规则，且要满足美学需求，需要具备和患者颅脑轮廓一致的结构，因此对颅骨修补材料提出了更高要求。3D 打印技术为实现颅骨修补材料的个性化制备提供了可能。对于仿生矿化胶原骨材料，开发新的 3D 打印技术能够实现多孔和致密骨材料的打印，保证矿化胶原的稳定性和生物活性，以及骨材料的强度，是当前研究的重点。
作者贡献：李博负责撰稿、文章逻辑、技术数段；王硕负责撰稿、文章逻辑；赵勇刚负责撰稿、校稿、图片处理；王秀梅负责实验经费、实验思路、文章构架、撰稿。
利益冲突：所有作者声明，在课题研究和文章撰写过程中不存在利益冲突。经费支持未影响文章观点。
