引用本文： 林俊卿, 黄腾立, 高涛, 郑宪友. 内皮祖细胞来源小细胞外囊泡促进小鼠脊髓损伤修复的实验研究. 中国修复重建外科杂志, 2021, 35(4): 488-495. doi: 10.7507/1002-1892.202009130 复制
脊髓损伤是指外伤、肿瘤等因素导致脊髓组织完整性被破坏，进而引起一系列运动、感觉及自主神经功能障碍的一种疾病[1]。脊髓损伤后自我修复能力有限，目前尚无有效治疗方法，预后往往不佳，给患者及家庭带来巨大负担[2-3]。如何促进脊髓修复一直是临床亟待解决的难题之一[4]。研究表明，血管新生在脊髓修复中具有重要意义，新生血管既可作为支架引导轴突再生，又可为损伤区域供血供氧，为修复提供必要的营养物质[5]。内皮祖细胞（endothelial progenitor cells，EPCs）是一种来源于骨髓且具有多向分化能力的细胞，作为血管来源祖细胞，在血管修复中起到关键作用[6]。研究发现，内皮损伤后 EPCs 能在缺血或梗死区域产生新生血管，并充当细胞循环池中一员替代功能异常的内皮细胞[7]。此外，缺血性脑卒中患者循环中的 EPCs 增加与脑卒中预后密切相关，进一步提示了 EPCs 促血管新生作用及其在脊髓损伤修复中的潜在能力[8]。
研究报道干细胞介导的血管新生及组织再生可能是通过旁分泌作用实现，其中小细胞外囊泡（small extracellular vesicles，sEVs）发挥了重要的桥接作用[9]。sEVs 是一类由细胞分泌且直径<200 nm 的脂质双层膜囊泡，它能够选择性包裹蛋白质、脂质、生长因子及编码和非编码 RNA 等多种生物活性物质，参与细胞间交流。由于本身体积较小，携带宿主抗原较少，并且不携带大量基因组 DNA，所以相比干细胞，sEVs 更适合用于临床治疗[10]。EPCs-sEVs 作为沟通血管内皮细胞与 EPCs 之间的重要桥梁，在促进内皮细胞新生中具有重要作用。目前 EPCs-sEVs 多用于心血管系统相关疾病治疗中，罕见用于脊髓损伤的治疗。为此，本研究将 EPCs-sEVs 用于干预脊髓损伤小鼠，明确其治疗脊髓损伤的疗效，初步探索治疗可能机制。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂、仪器
4 周龄 SPF 级 C57BL/6 雄性小鼠 20 只，体质量 15～20 g，用于 EPCs 的提取。10 周龄 SPF 级 C57BL/6 雌性小鼠 43 只，体质量 30～35 g，用于脊髓损伤模型制备。实验动物均由上海交通大学附属第六人民医院提供。
EPCs 培养基（Lonza 公司，瑞士）；纤维连接蛋白、Dil 标记的乙酰化低密度脂蛋白（Dil labeled acetylated low density lipoprotein，Dil-AcLDL；北京索莱宝生物技术有限公司）；FITC 标记的凝集素 1（FITC labeled Ulex europaeus agglutinin 1，FITC-UEA-1；Sigma 公司，美国）；CD133、CD34 及 VEGF 受体 2（VEGF receptor 2，VEGFR2）流式抗体（Biolengend 公司，美国）；FBS、双抗、EDTA-胰蛋白酶（GIBCO 公司，美国）；CD31、CD9、CD63 及 gm130 抗体（Abcam 公司，英国）。
微量注射器（Hamilton 公司，美国）；激光共聚焦显微镜、倒置相差显微镜（Leica 公司，德国）；超速离心管、超速离心机（Beckman 公司，美国）；Western 电泳系统（Bio-Rad 公司，美国）；纳米流式检测仪（厦门福流生物科技有限公司）；透射电镜（JEOL 公司，日本）；流式检测仪（BD 公司，美国）；活体成像仪（上海天能科技有限公司）；电子 Von Frey 测痛仪（Bioseb 公司，法国）；Image J 软件（美国国立卫生研究院）。
1.2 EPCs 分离培养及鉴定
1.2.1 EPCs 分离培养
根据文献［11］报道方案分离培养小鼠 EPCs。将 20 只小鼠给予过量麻醉药物处死，置于 75% 乙醇中浸泡 30 min 后，取股骨及胫骨并清除周围组织肌肉；使用针筒在 EPCs 完全培养基中冲洗骨髓腔 10 次，收集冲洗液；以 300×g 离心 5 min，弃上清，使用 EPCs 培养基重悬，并将细胞接种于已预铺纤维连接蛋白的培养皿中，置于 37℃、5%CO2 培养箱中培养。培养 3 d 后取出培养皿，使用 PBS 冲洗未贴壁细胞及红细胞碎片，加入新的 EPCs 完全培养基，置于培养箱中继续培养 7～10 d，倒置相差显微镜下观察细胞形态；待细胞融合达 80% 时进行传代。
1.2.2 EPCs 鉴定
参照文献［12］方法对 EPCs 进行鉴定。① 流式细胞术：取 P2 代贴壁 EPCs，以 0.25% EDTA-胰蛋白酶消化后制备成细胞悬液；使用 CD133、CD34 及 VEGFR2 流式抗体孵育 20 min，PBS 清洗 3 次，纳米流式检测仪检测。② 双荧光染色观察：取 P2 代 EPCs，按照 1∶3 细胞传代比例接种至带有细胞爬片的 24 孔板中；待培养 24 h 细胞贴壁后，Dil-AcLDL 避光孵育 4 h，PBST 清洗孔板 3 次，4% 多聚甲醛固定 15 min，FITC-UEA-1 孵育 1 h，DAPI 孵育 5 min，PBST 清洗孔板 3 次，取细胞爬片于激光共聚焦显微镜观察，Dil-AcLDL 呈红色荧光染色，FITC-UEA-1 呈绿色荧光染色，DAPI 呈蓝色荧光染色。
1.3 EPCs-sEVs 的提取与鉴定
1.3.1 EPCs-sEVs 的提取及标记
EPCs 培养至 P4 代，期间收集 P2～P4 代培养上清。将细胞上清置于离心管中，以 300×g 离心 10 min、2 000×g 离心 30 min、10 000×g 离心 30 min，弃沉淀。将上清转移至超速离心管中，以 100 000×g 离心 70 min，弃上清，加入 PBS 重悬；再次以 100 000×g 离心 70 min，弃上清，PBS 重悬后底部沉淀即为 EPCs-sEVs。
取部分 EPCs-sEVs 室温下使用 DiR 标记，加入 PBS 重悬，以 100 000×g 离心 70 min，弃上清，同上法加入 PBS 重悬并以 100 000×g 离心 70 min，重复 3 次，以清除残余染液。
1.3.2 EPCs-sEVs 的鉴定
① 透射电镜观察 EPCs-sEVs 的形态；② 纳米流式检测仪检测 EPCs-sEVs 的粒径分布及浓度；③ 将 EPCs-sEVs 以及 EPCs 使用 RIAP 裂解后，使用 4×Loading buffer 进行稀释，提取蛋白行 Western blot 检测（CD9、CD63 及 gm130），以确定 EPCs-sECs 的表面标志物。
1.4 实验分组及方法
取 40 只雌性小鼠随机分为 4 组，分别为假手术组、模型组、低浓度干预组及高浓度干预组，每组 10 只。
各组小鼠经吸入异氟烷麻醉后，作背部正中切口，去除 T10 椎板，暴露脊髓；假手术组直接关闭切口，其余各组制备脊髓损伤模型。具体方法：采用改良 Allen 脊髓损伤打击器，按照高度 1 cm、打击棒质量 10 g 的打击条件对脊髓组织进行打击。打击后小鼠双下肢出现抽动并甩尾，麻醉苏醒后小鼠双下肢瘫痪，打击位点出现暗红色血液提示模型制备成功[13]。
模型制备后，模型组不作其他处理，低、高浓度干预组分别于模型制备后 30 min、3 d 及 7 d 经尾静脉对应注射浓度为 1×109、1×1010 个/mL 的 EPCs-sEVs，每只注射 50 μL。术后小鼠每日人工排便、排尿直至恢复自主排便、排尿反射。
1.5 观测指标
1.5.1 小鼠脊髓活体成像观察
取 3 只雌性小鼠参照 1.4 方法制备脊髓损伤模型后，于尾静脉注射 DiR 标记的 EPCs-sEVs，30 min 后给予过量麻醉药物处死后，按照原切口入路，取出胸段脊柱，切取包括损伤部位上、下 0.5 cm 范围的脊髓组织，置于活体成像仪中观察损伤部位荧光信号，以观察注射的 EPCs-sEVs 是否到达脊髓损伤部位。
1.5.2 小鼠行为学检测
① BMS 评分：术后 1、3 d 及 1、2、3、4 周观察各组小鼠后肢运动功能恢复情况，根据 BMS 评分量表[13]进行评分，0 分表示完全瘫痪，9 分表示完全正常。② 斜板实验：术后 1、2、3、4 周将小鼠放置于自制斜板上，记录其在斜板上能够停留至少 5 s 的最大角度。③ Von Frey 实验：术后 4 周采用电子 Von Frey 测痛仪测量机械痛阈值。将传感器尖端对准小鼠足底中央区，逐渐增加针刺强度，小鼠出现缩足、甩腿、舔舐及抬腿等疼痛相关行为反应记为阳性反应，出现 3 次阳性反应的最低刺激强度（g）即为小鼠机械痛阈值。
1.5.3 组织学观察
① HE 染色：术后 4 周行为学检测后，给予过量麻醉药物处死全部小鼠，切取包括损伤部位上、下 0.5 cm 范围的脊髓组织。大体观察组织损伤情况后，以蔗糖密度梯度脱水，取部分脊髓组织冰冻切片，片厚 5 μm，常规 HE 染色，倒置相差显微镜下观察。
② 免疫组织化学染色：取部分脊髓组织冰冻切片，片厚 25 μm，置于 0.01%Triton 破膜，牛血清白蛋白封闭，一抗 CD31（1∶200）孵育过夜后，滴加辣根过氧化物酶标记二抗孵育，DAB 显色，苏木素染核，封片，倒置相差显微镜下观察。使用 Image J 软件测量积分吸光度（IA）值，每组选择至少 3 个视野进行统计分析。
1.6 统计学方法
采用 SPSS26.0 及 Prism8.0 软件进行统计分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用 Tukey 检验；检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 EPCs 分离培养及鉴定
培养 7 d 后倒置相差显微镜下可见 EPCs 呈铺路石样排列生长于培养皿中，传代后细胞形态与传代前一致。流式细胞术检测显示，CD133、CD34 及 VEGFR2 阳性细胞分别占 99.3%、99.1%、93.9%。Dil-AcLDL 及 FITC-UEA-1 双荧光染色观察示，细胞具有吞噬 Dil-AcLDL 能力且能被 FITC-UEA-1 结合。经鉴定，分离培养细胞为 EPCs。见图 1。
图1
EPCs 细胞形态观察及鉴定
a. 培养 7 d 细胞形态（倒置相差显微镜×100）；b. P2 代细胞形态（倒置相差显微镜×100）；c. Dil-Ac-LDL 和 FITC-UEA-1 双荧光染色观察（激光共聚焦显微镜×400）；d. 流式细胞术鉴定
Figure1. Cell morphology observation and identification of EPCsa. Cell morphology after 7 days of culture (Inverted phase contrast microscope×100); b. The morphology of the P2 generation cells (Inverted phase contrast microscope×100); c. Double fluorescence staining of Dil-Ac-LDL and FITC-UEA-1 (Laser scanning confocal microscope×400); d. Flow cytometry identification
2.2 EPCs-sEVs 的鉴定
透射电镜观察见 EPCs-sEVs 具有典型的脂质双分子层结构，呈杯状，大小介于 30～150 nm。纳米流式检测仪检测示 EPCs-sEVs 粒径均<200 nm，多数介于 30～150 nm；浓度在 5×109～1×1010 个/mL 范围内波动。Western blot 检测显示 EPCs-sEVs CD9 及 CD63 表达阳性、gm130 表达阴性，EPCs CD9、CD63 及 gm130 表达均为阳性。上述鉴定结果提示成功提取 EPCs-sEVs。见图 2。
图2
EPCs-sEVs 的鉴定
a. 透射电镜观察（×67 k）；b. 纳米流式检测仪检测 EPCs-sEVs 粒径分布；c. Western blot 检测 1：EPCs 2：EPCs-sEVs
Figure2. The identification of EPCs-sEVsa. Transmission electron microscope observation (×67 k); b. Nanoflow cytometry detection of EPCs-sEVs particle size distribution; c. Western blot detection 1: EPCs 2: EPCs-sEVs
2.3 动物实验观察
2.3.1 小鼠脊髓活体成像观察
活体成像仪观察显示 DiR 标记的 EPCs-sEVs 在注射后 30 min 内募集至脊髓损伤区域。见图 3。
图3
活体成像仪观察
箭头示 EPCs-sEVs 募集至脊髓损伤部位
Figure3. In vivo imaging of the spinal cordArrow indicated the recruitment of EPCs-sEVs to the spinal cord injury site
2.3.2 小鼠行为学检测
① BMS 评分：各时间点，假手术组 BMS 评分均明显高于其他组，差异有统计学意义（P<0.05）。术后 1、3 d 及 1 周，两干预组 BMS 评分与模型组比较差异均无统计学意义（P>0.05）；2、3、4 周明显高于模型组，差异有统计学意义（P<0.05）。各时间点两干预组间差异均无统计学意义（P>0.05）。两干预组及模型组小鼠术后 2 周后 BMS 评分进入平台期。见图 4。
图4
术后各时间点各组小鼠 BMS 评分
Figure4.
BMS score of each group at each time point
② 斜板实验：各时间点，假手术组最大角度均明显大于其他组，差异有统计学意义（P<0.05）。术后 1 周，两干预组最大角度与模型组比较差异均无统计学意义（P>0.05）；2、3、4 周明显大于模型组，差异有统计学意义（P<0.05）。各时间点，两干预组间差异均无统计学意义（P>0.05）。见表 1。
表1
各时间点各组斜板实验最大角度（n=5，
，°）
Table1.
The maxium angles of inclined plant test at different time points (n=5, 
, °)
③ Von Frey 实验：术后 4 周，假手术组、模型组以及低、高浓度干预组小鼠机械痛阈值分别为 1.00±0.06、0.16±0.04、0.33±0.06、0.34±0.05。两干预组机械痛阈值明显高于模型组、低于假手术组，差异均有统计学意义（P<0.05），但两干预组间比较差异无统计学意义（P>0.05）。
2.4 组织学观察
2.4.1 HE 染色
术后 4 周取材时可见模型组损伤节段脊髓组织缺损明显大于两干预组，两干预组大体观察无明显差异（图 5）。HE 染色镜下观察，假手术组为正常脊髓组织结构；模型组可见大量组织坏死、单个核细胞浸润，组织形态结构紊乱；两干预组损伤脊髓组织坏死程度明显轻于模型组，单个核细胞浸润明显减少，两干预组间无明显差异。见图 6。
图5
术后 4 周各组脊髓组织大体观察
1～4 分别为假手术组、模型组、低浓度干预组、高浓度干预组
Figure5. The gross observation of spinal cord tissue in each group at 4 weeks after operation1-4 for the sham group, model group, low concentration intervention group, and high concentration intervention group, respectively
图6
术后 4 周各组 HE 染色观察（倒置相差显微镜×100）
a. 假手术组；b. 模型组；c. 低浓度干预组；d. 高浓度干预组
Figure6. HE staining of each group at 4 weeks after operation (Inverted phase contrast microscope×100)a. Sham group; b. Model group; c. Low concentration intervention group; d. High concentration intervention group
2.4.2 免疫组织化学染色
镜下观察见假手术组血管分布规则；两干预组 CD31 血管染色较模型组更深，两干预组间无明显差异。见图 7。定量分析显示假手术组、模型组以及低、高浓度干预组 IA 值分别为 1.00±0.19、0.04±0.03、0.45±0.18、0.45±0.13。两干预组 IA 值明显高于模型组、低于假手术组，差异均有统计学意义（P<0.05），但两干预组间比较差异无统计学意义（P>0.05）。
图7
术后 4 周各组免疫组织化学染色观察（倒置相差显微镜×200）
箭头示新生血管 a. 假手术组；b. 模型组；c. 低浓度干预组；d. 高浓度干预组
Figure7. Immunohistochemical staining of each group at 4 weeks after operation (Inverted phase contrast microscope×200)Arrows showed the neovascularization a. Sham group; b. Model group; c. Low concentration intervention group; d. High concentration intervention group
3 讨论
研究表明，干细胞用作移植物治疗脊髓损伤时，能够通过分泌生长因子、调节免疫反应，促进神经环路重建及使脱髓鞘神经再髓鞘化等途径，促进损伤神经再生[14]。目前多选择移植 MSCs 及神经干细胞，获得了一定治疗效果。但干细胞治疗脊髓损伤存在安全性较低、免疫排斥反应、存储条件严格、获取来源有限等问题，在一定程度上限制了其临床转化[15]。而干细胞来源的 sEVs 由于不存在干细胞移植中所面临的免疫排斥反应等问题，显示出较好的临床转化前景，目前已在多种组织修复治疗中获得较好效果[16]。
目前，sEVs 用于中枢神经系统损伤的治疗研究已较多。研究显示 sEVs 可能通过以下 3 种机制促进中枢神经系统损伤修复。① 在创伤性中枢神经系统损伤模型中使用 sEVs 治疗后，循环中的中性粒细胞及单核细胞减少，提示 sEVs 可能通过缓解炎症反应促进中枢神经组织修复[16]。② Zhang 等[17]的研究使用来源于 MSCs 的 sEVs 干预创伤性脑损伤模型，发现损伤部位血管密度增加，提示 sEVs 可通过促进血管新生，进而促进中枢神经组织修复。③ sEVs 可直接刺激神经轴突的再生来促进中枢神经组织修复[16]。
本研究发现 EPCs-sEVs 能促进脊髓损伤后功能恢复，术后 1 周内两干预组小鼠后肢功能与模型组无明显差异，但 2 周后小鼠后肢运动功能及感觉评价明显高于模型组；术后 4 周，组织学观察显示两干预组组织学结构恢复程度亦优于模型组，且免疫组织化学染色示新生血管更多。上述研究结果提示 EPCs-sEVs 可促进小鼠脊髓损伤的修复，作用机制可能是通过促进脊髓损伤部位血管新生而实现。目前已有诸多研究证据支持 EPCs-sEVs 在血管新生方面有着与 EPCs 相同的效果[18-20]。Li 等[21]研究证实 EPCs-sEVs 可通过增加血管生成相关分子的表达来促进血管内皮修复。此外，研究还认为 EPCs-sEVs 可通过向周围靶细胞传递 miRNA-214，促进内皮细胞的增殖及分化，减少内皮细胞衰老，从而促进血管新生[22]。早期血管损伤后，局部残存的神经元缺血、缺氧，导致局部组织出现二次损伤[23]。此外，血管新生还能为神经生长铺设一条快速通道，便于神经轴突再生，因此促进脊髓损伤部位血管新生具有重要意义[24]。
目前，EPCs-sEVs 中促进脊髓损伤部位血管新生的有效成分尚未明确，有待后续深入研究，以期发现有效的促进血管新生的分子或 miRNA，进而通过人工制作脂质体包裹有效分子或 miRNA 达到直接替代 sEVs 促进脊髓损伤部位血管新生的目的。此外，本研究仅以小鼠作为研究模型，后续还需进一步在大型动物水平验证 EPCs-sEVs 在治疗脊髓损伤中的作用，以期为临床转化提供临床前研究证据。
志谢：上海交通大学附属第六人民医院四肢显微外科研究所。
作者贡献：林俊卿参与研究设计和实施，数据收集及撰写文章；黄腾立参与研究实施及数据收集；高涛参与文章撰写并作批评性审阅；郑宪友参与研究设计及对文章的知识性内容作批评性审阅。
利益冲突：所有作者声明，在课题研究及文章撰写过程中不存在利益冲突。基金项目经费支持没有影响文章观点和对研究数据客观结果的统计学分析及其报道。
机构伦理问题：研究方案经上海交通大学附属第六人民医院医学伦理委员会批准（DWSY2020-0605）。动物实验程序及开展方案符合动物使用及管理委员会规定。实验动物使用许可证号：SYXK（沪）2016-0020。
脊髓损伤是指外伤、肿瘤等因素导致脊髓组织完整性被破坏，进而引起一系列运动、感觉及自主神经功能障碍的一种疾病[1]。脊髓损伤后自我修复能力有限，目前尚无有效治疗方法，预后往往不佳，给患者及家庭带来巨大负担[2-3]。如何促进脊髓修复一直是临床亟待解决的难题之一[4]。研究表明，血管新生在脊髓修复中具有重要意义，新生血管既可作为支架引导轴突再生，又可为损伤区域供血供氧，为修复提供必要的营养物质[5]。内皮祖细胞（endothelial progenitor cells，EPCs）是一种来源于骨髓且具有多向分化能力的细胞，作为血管来源祖细胞，在血管修复中起到关键作用[6]。研究发现，内皮损伤后 EPCs 能在缺血或梗死区域产生新生血管，并充当细胞循环池中一员替代功能异常的内皮细胞[7]。此外，缺血性脑卒中患者循环中的 EPCs 增加与脑卒中预后密切相关，进一步提示了 EPCs 促血管新生作用及其在脊髓损伤修复中的潜在能力[8]。
研究报道干细胞介导的血管新生及组织再生可能是通过旁分泌作用实现，其中小细胞外囊泡（small extracellular vesicles，sEVs）发挥了重要的桥接作用[9]。sEVs 是一类由细胞分泌且直径<200 nm 的脂质双层膜囊泡，它能够选择性包裹蛋白质、脂质、生长因子及编码和非编码 RNA 等多种生物活性物质，参与细胞间交流。由于本身体积较小，携带宿主抗原较少，并且不携带大量基因组 DNA，所以相比干细胞，sEVs 更适合用于临床治疗[10]。EPCs-sEVs 作为沟通血管内皮细胞与 EPCs 之间的重要桥梁，在促进内皮细胞新生中具有重要作用。目前 EPCs-sEVs 多用于心血管系统相关疾病治疗中，罕见用于脊髓损伤的治疗。为此，本研究将 EPCs-sEVs 用于干预脊髓损伤小鼠，明确其治疗脊髓损伤的疗效，初步探索治疗可能机制。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂、仪器
4 周龄 SPF 级 C57BL/6 雄性小鼠 20 只，体质量 15～20 g，用于 EPCs 的提取。10 周龄 SPF 级 C57BL/6 雌性小鼠 43 只，体质量 30～35 g，用于脊髓损伤模型制备。实验动物均由上海交通大学附属第六人民医院提供。
EPCs 培养基（Lonza 公司，瑞士）；纤维连接蛋白、Dil 标记的乙酰化低密度脂蛋白（Dil labeled acetylated low density lipoprotein，Dil-AcLDL；北京索莱宝生物技术有限公司）；FITC 标记的凝集素 1（FITC labeled Ulex europaeus agglutinin 1，FITC-UEA-1；Sigma 公司，美国）；CD133、CD34 及 VEGF 受体 2（VEGF receptor 2，VEGFR2）流式抗体（Biolengend 公司，美国）；FBS、双抗、EDTA-胰蛋白酶（GIBCO 公司，美国）；CD31、CD9、CD63 及 gm130 抗体（Abcam 公司，英国）。
微量注射器（Hamilton 公司，美国）；激光共聚焦显微镜、倒置相差显微镜（Leica 公司，德国）；超速离心管、超速离心机（Beckman 公司，美国）；Western 电泳系统（Bio-Rad 公司，美国）；纳米流式检测仪（厦门福流生物科技有限公司）；透射电镜（JEOL 公司，日本）；流式检测仪（BD 公司，美国）；活体成像仪（上海天能科技有限公司）；电子 Von Frey 测痛仪（Bioseb 公司，法国）；Image J 软件（美国国立卫生研究院）。
1.2 EPCs 分离培养及鉴定
1.2.1 EPCs 分离培养
根据文献［11］报道方案分离培养小鼠 EPCs。将 20 只小鼠给予过量麻醉药物处死，置于 75% 乙醇中浸泡 30 min 后，取股骨及胫骨并清除周围组织肌肉；使用针筒在 EPCs 完全培养基中冲洗骨髓腔 10 次，收集冲洗液；以 300×g 离心 5 min，弃上清，使用 EPCs 培养基重悬，并将细胞接种于已预铺纤维连接蛋白的培养皿中，置于 37℃、5%CO2 培养箱中培养。培养 3 d 后取出培养皿，使用 PBS 冲洗未贴壁细胞及红细胞碎片，加入新的 EPCs 完全培养基，置于培养箱中继续培养 7～10 d，倒置相差显微镜下观察细胞形态；待细胞融合达 80% 时进行传代。
1.2.2 EPCs 鉴定
参照文献［12］方法对 EPCs 进行鉴定。① 流式细胞术：取 P2 代贴壁 EPCs，以 0.25% EDTA-胰蛋白酶消化后制备成细胞悬液；使用 CD133、CD34 及 VEGFR2 流式抗体孵育 20 min，PBS 清洗 3 次，纳米流式检测仪检测。② 双荧光染色观察：取 P2 代 EPCs，按照 1∶3 细胞传代比例接种至带有细胞爬片的 24 孔板中；待培养 24 h 细胞贴壁后，Dil-AcLDL 避光孵育 4 h，PBST 清洗孔板 3 次，4% 多聚甲醛固定 15 min，FITC-UEA-1 孵育 1 h，DAPI 孵育 5 min，PBST 清洗孔板 3 次，取细胞爬片于激光共聚焦显微镜观察，Dil-AcLDL 呈红色荧光染色，FITC-UEA-1 呈绿色荧光染色，DAPI 呈蓝色荧光染色。
1.3 EPCs-sEVs 的提取与鉴定
1.3.1 EPCs-sEVs 的提取及标记
EPCs 培养至 P4 代，期间收集 P2～P4 代培养上清。将细胞上清置于离心管中，以 300×g 离心 10 min、2 000×g 离心 30 min、10 000×g 离心 30 min，弃沉淀。将上清转移至超速离心管中，以 100 000×g 离心 70 min，弃上清，加入 PBS 重悬；再次以 100 000×g 离心 70 min，弃上清，PBS 重悬后底部沉淀即为 EPCs-sEVs。
取部分 EPCs-sEVs 室温下使用 DiR 标记，加入 PBS 重悬，以 100 000×g 离心 70 min，弃上清，同上法加入 PBS 重悬并以 100 000×g 离心 70 min，重复 3 次，以清除残余染液。
1.3.2 EPCs-sEVs 的鉴定
① 透射电镜观察 EPCs-sEVs 的形态；② 纳米流式检测仪检测 EPCs-sEVs 的粒径分布及浓度；③ 将 EPCs-sEVs 以及 EPCs 使用 RIAP 裂解后，使用 4×Loading buffer 进行稀释，提取蛋白行 Western blot 检测（CD9、CD63 及 gm130），以确定 EPCs-sECs 的表面标志物。
1.4 实验分组及方法
取 40 只雌性小鼠随机分为 4 组，分别为假手术组、模型组、低浓度干预组及高浓度干预组，每组 10 只。
各组小鼠经吸入异氟烷麻醉后，作背部正中切口，去除 T10 椎板，暴露脊髓；假手术组直接关闭切口，其余各组制备脊髓损伤模型。具体方法：采用改良 Allen 脊髓损伤打击器，按照高度 1 cm、打击棒质量 10 g 的打击条件对脊髓组织进行打击。打击后小鼠双下肢出现抽动并甩尾，麻醉苏醒后小鼠双下肢瘫痪，打击位点出现暗红色血液提示模型制备成功[13]。
模型制备后，模型组不作其他处理，低、高浓度干预组分别于模型制备后 30 min、3 d 及 7 d 经尾静脉对应注射浓度为 1×109、1×1010 个/mL 的 EPCs-sEVs，每只注射 50 μL。术后小鼠每日人工排便、排尿直至恢复自主排便、排尿反射。
1.5 观测指标
1.5.1 小鼠脊髓活体成像观察
取 3 只雌性小鼠参照 1.4 方法制备脊髓损伤模型后，于尾静脉注射 DiR 标记的 EPCs-sEVs，30 min 后给予过量麻醉药物处死后，按照原切口入路，取出胸段脊柱，切取包括损伤部位上、下 0.5 cm 范围的脊髓组织，置于活体成像仪中观察损伤部位荧光信号，以观察注射的 EPCs-sEVs 是否到达脊髓损伤部位。
1.5.2 小鼠行为学检测
① BMS 评分：术后 1、3 d 及 1、2、3、4 周观察各组小鼠后肢运动功能恢复情况，根据 BMS 评分量表[13]进行评分，0 分表示完全瘫痪，9 分表示完全正常。② 斜板实验：术后 1、2、3、4 周将小鼠放置于自制斜板上，记录其在斜板上能够停留至少 5 s 的最大角度。③ Von Frey 实验：术后 4 周采用电子 Von Frey 测痛仪测量机械痛阈值。将传感器尖端对准小鼠足底中央区，逐渐增加针刺强度，小鼠出现缩足、甩腿、舔舐及抬腿等疼痛相关行为反应记为阳性反应，出现 3 次阳性反应的最低刺激强度（g）即为小鼠机械痛阈值。
1.5.3 组织学观察
① HE 染色：术后 4 周行为学检测后，给予过量麻醉药物处死全部小鼠，切取包括损伤部位上、下 0.5 cm 范围的脊髓组织。大体观察组织损伤情况后，以蔗糖密度梯度脱水，取部分脊髓组织冰冻切片，片厚 5 μm，常规 HE 染色，倒置相差显微镜下观察。
② 免疫组织化学染色：取部分脊髓组织冰冻切片，片厚 25 μm，置于 0.01%Triton 破膜，牛血清白蛋白封闭，一抗 CD31（1∶200）孵育过夜后，滴加辣根过氧化物酶标记二抗孵育，DAB 显色，苏木素染核，封片，倒置相差显微镜下观察。使用 Image J 软件测量积分吸光度（IA）值，每组选择至少 3 个视野进行统计分析。
1.6 统计学方法
采用 SPSS26.0 及 Prism8.0 软件进行统计分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用 Tukey 检验；检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 EPCs 分离培养及鉴定
培养 7 d 后倒置相差显微镜下可见 EPCs 呈铺路石样排列生长于培养皿中，传代后细胞形态与传代前一致。流式细胞术检测显示，CD133、CD34 及 VEGFR2 阳性细胞分别占 99.3%、99.1%、93.9%。Dil-AcLDL 及 FITC-UEA-1 双荧光染色观察示，细胞具有吞噬 Dil-AcLDL 能力且能被 FITC-UEA-1 结合。经鉴定，分离培养细胞为 EPCs。见图 1。
图1
EPCs 细胞形态观察及鉴定
a. 培养 7 d 细胞形态（倒置相差显微镜×100）；b. P2 代细胞形态（倒置相差显微镜×100）；c. Dil-Ac-LDL 和 FITC-UEA-1 双荧光染色观察（激光共聚焦显微镜×400）；d. 流式细胞术鉴定
Figure1. Cell morphology observation and identification of EPCsa. Cell morphology after 7 days of culture (Inverted phase contrast microscope×100); b. The morphology of the P2 generation cells (Inverted phase contrast microscope×100); c. Double fluorescence staining of Dil-Ac-LDL and FITC-UEA-1 (Laser scanning confocal microscope×400); d. Flow cytometry identification
2.2 EPCs-sEVs 的鉴定
透射电镜观察见 EPCs-sEVs 具有典型的脂质双分子层结构，呈杯状，大小介于 30～150 nm。纳米流式检测仪检测示 EPCs-sEVs 粒径均<200 nm，多数介于 30～150 nm；浓度在 5×109～1×1010 个/mL 范围内波动。Western blot 检测显示 EPCs-sEVs CD9 及 CD63 表达阳性、gm130 表达阴性，EPCs CD9、CD63 及 gm130 表达均为阳性。上述鉴定结果提示成功提取 EPCs-sEVs。见图 2。
图2
EPCs-sEVs 的鉴定
a. 透射电镜观察（×67 k）；b. 纳米流式检测仪检测 EPCs-sEVs 粒径分布；c. Western blot 检测 1：EPCs 2：EPCs-sEVs
Figure2. The identification of EPCs-sEVsa. Transmission electron microscope observation (×67 k); b. Nanoflow cytometry detection of EPCs-sEVs particle size distribution; c. Western blot detection 1: EPCs 2: EPCs-sEVs
2.3 动物实验观察
2.3.1 小鼠脊髓活体成像观察
活体成像仪观察显示 DiR 标记的 EPCs-sEVs 在注射后 30 min 内募集至脊髓损伤区域。见图 3。
图3
活体成像仪观察
箭头示 EPCs-sEVs 募集至脊髓损伤部位
Figure3. In vivo imaging of the spinal cordArrow indicated the recruitment of EPCs-sEVs to the spinal cord injury site
2.3.2 小鼠行为学检测
① BMS 评分：各时间点，假手术组 BMS 评分均明显高于其他组，差异有统计学意义（P<0.05）。术后 1、3 d 及 1 周，两干预组 BMS 评分与模型组比较差异均无统计学意义（P>0.05）；2、3、4 周明显高于模型组，差异有统计学意义（P<0.05）。各时间点两干预组间差异均无统计学意义（P>0.05）。两干预组及模型组小鼠术后 2 周后 BMS 评分进入平台期。见图 4。
图4
术后各时间点各组小鼠 BMS 评分
Figure4.
BMS score of each group at each time point
② 斜板实验：各时间点，假手术组最大角度均明显大于其他组，差异有统计学意义（P<0.05）。术后 1 周，两干预组最大角度与模型组比较差异均无统计学意义（P>0.05）；2、3、4 周明显大于模型组，差异有统计学意义（P<0.05）。各时间点，两干预组间差异均无统计学意义（P>0.05）。见表 1。
表1
各时间点各组斜板实验最大角度（n=5，，°）
Table1.
The maxium angles of inclined plant test at different time points (n=5, , °)
③ Von Frey 实验：术后 4 周，假手术组、模型组以及低、高浓度干预组小鼠机械痛阈值分别为 1.00±0.06、0.16±0.04、0.33±0.06、0.34±0.05。两干预组机械痛阈值明显高于模型组、低于假手术组，差异均有统计学意义（P<0.05），但两干预组间比较差异无统计学意义（P>0.05）。
2.4 组织学观察
2.4.1 HE 染色
术后 4 周取材时可见模型组损伤节段脊髓组织缺损明显大于两干预组，两干预组大体观察无明显差异（图 5）。HE 染色镜下观察，假手术组为正常脊髓组织结构；模型组可见大量组织坏死、单个核细胞浸润，组织形态结构紊乱；两干预组损伤脊髓组织坏死程度明显轻于模型组，单个核细胞浸润明显减少，两干预组间无明显差异。见图 6。
图5
术后 4 周各组脊髓组织大体观察
1～4 分别为假手术组、模型组、低浓度干预组、高浓度干预组
Figure5. The gross observation of spinal cord tissue in each group at 4 weeks after operation1-4 for the sham group, model group, low concentration intervention group, and high concentration intervention group, respectively
图6
术后 4 周各组 HE 染色观察（倒置相差显微镜×100）
a. 假手术组；b. 模型组；c. 低浓度干预组；d. 高浓度干预组
Figure6. HE staining of each group at 4 weeks after operation (Inverted phase contrast microscope×100)a. Sham group; b. Model group; c. Low concentration intervention group; d. High concentration intervention group
2.4.2 免疫组织化学染色
镜下观察见假手术组血管分布规则；两干预组 CD31 血管染色较模型组更深，两干预组间无明显差异。见图 7。定量分析显示假手术组、模型组以及低、高浓度干预组 IA 值分别为 1.00±0.19、0.04±0.03、0.45±0.18、0.45±0.13。两干预组 IA 值明显高于模型组、低于假手术组，差异均有统计学意义（P<0.05），但两干预组间比较差异无统计学意义（P>0.05）。
图7
术后 4 周各组免疫组织化学染色观察（倒置相差显微镜×200）
箭头示新生血管 a. 假手术组；b. 模型组；c. 低浓度干预组；d. 高浓度干预组
Figure7. Immunohistochemical staining of each group at 4 weeks after operation (Inverted phase contrast microscope×200)Arrows showed the neovascularization a. Sham group; b. Model group; c. Low concentration intervention group; d. High concentration intervention group
3 讨论
研究表明，干细胞用作移植物治疗脊髓损伤时，能够通过分泌生长因子、调节免疫反应，促进神经环路重建及使脱髓鞘神经再髓鞘化等途径，促进损伤神经再生[14]。目前多选择移植 MSCs 及神经干细胞，获得了一定治疗效果。但干细胞治疗脊髓损伤存在安全性较低、免疫排斥反应、存储条件严格、获取来源有限等问题，在一定程度上限制了其临床转化[15]。而干细胞来源的 sEVs 由于不存在干细胞移植中所面临的免疫排斥反应等问题，显示出较好的临床转化前景，目前已在多种组织修复治疗中获得较好效果[16]。
目前，sEVs 用于中枢神经系统损伤的治疗研究已较多。研究显示 sEVs 可能通过以下 3 种机制促进中枢神经系统损伤修复。① 在创伤性中枢神经系统损伤模型中使用 sEVs 治疗后，循环中的中性粒细胞及单核细胞减少，提示 sEVs 可能通过缓解炎症反应促进中枢神经组织修复[16]。② Zhang 等[17]的研究使用来源于 MSCs 的 sEVs 干预创伤性脑损伤模型，发现损伤部位血管密度增加，提示 sEVs 可通过促进血管新生，进而促进中枢神经组织修复。③ sEVs 可直接刺激神经轴突的再生来促进中枢神经组织修复[16]。
本研究发现 EPCs-sEVs 能促进脊髓损伤后功能恢复，术后 1 周内两干预组小鼠后肢功能与模型组无明显差异，但 2 周后小鼠后肢运动功能及感觉评价明显高于模型组；术后 4 周，组织学观察显示两干预组组织学结构恢复程度亦优于模型组，且免疫组织化学染色示新生血管更多。上述研究结果提示 EPCs-sEVs 可促进小鼠脊髓损伤的修复，作用机制可能是通过促进脊髓损伤部位血管新生而实现。目前已有诸多研究证据支持 EPCs-sEVs 在血管新生方面有着与 EPCs 相同的效果[18-20]。Li 等[21]研究证实 EPCs-sEVs 可通过增加血管生成相关分子的表达来促进血管内皮修复。此外，研究还认为 EPCs-sEVs 可通过向周围靶细胞传递 miRNA-214，促进内皮细胞的增殖及分化，减少内皮细胞衰老，从而促进血管新生[22]。早期血管损伤后，局部残存的神经元缺血、缺氧，导致局部组织出现二次损伤[23]。此外，血管新生还能为神经生长铺设一条快速通道，便于神经轴突再生，因此促进脊髓损伤部位血管新生具有重要意义[24]。
目前，EPCs-sEVs 中促进脊髓损伤部位血管新生的有效成分尚未明确，有待后续深入研究，以期发现有效的促进血管新生的分子或 miRNA，进而通过人工制作脂质体包裹有效分子或 miRNA 达到直接替代 sEVs 促进脊髓损伤部位血管新生的目的。此外，本研究仅以小鼠作为研究模型，后续还需进一步在大型动物水平验证 EPCs-sEVs 在治疗脊髓损伤中的作用，以期为临床转化提供临床前研究证据。
志谢：上海交通大学附属第六人民医院四肢显微外科研究所。
作者贡献：林俊卿参与研究设计和实施，数据收集及撰写文章；黄腾立参与研究实施及数据收集；高涛参与文章撰写并作批评性审阅；郑宪友参与研究设计及对文章的知识性内容作批评性审阅。
利益冲突：所有作者声明，在课题研究及文章撰写过程中不存在利益冲突。基金项目经费支持没有影响文章观点和对研究数据客观结果的统计学分析及其报道。
机构伦理问题：研究方案经上海交通大学附属第六人民医院医学伦理委员会批准（DWSY2020-0605）。动物实验程序及开展方案符合动物使用及管理委员会规定。实验动物使用许可证号：SYXK（沪）2016-0020。
