MSCs 具有多向分化潜能，在组织工程及再生医学中具有良好的应用前景[1-2]。但从人体直接获得的 MSCs 有限，为了达到使用需求，常需进行体外扩增[3-4]。传统细胞扩增通常借助于培养瓶或培养皿在二维平面条件下进行传代培养，该法培养基利用率低，并且需要重复传代及更换培养基等操作，增加了耗材、劳动成本与污染风险[5]。此外，该法无法模拟 MSCs 在生物机体内复杂的微环境，长期传代培养的 MSCs 表现出增殖能力下降，并逐渐失去多向分化潜能[6-8]。基于多孔微载体三维动态培养的 MSCs 扩增策略，是将细胞接种于微载体上，进行搅拌悬浮培养或模拟微重力系统培养，不仅更加贴近细胞在体内的微环境[9-10]，而且由于微载体提供了大量供细胞生长贴附的表面面积，从而使空间及培养基利用率更大，更适合大范围扩增细胞。
微载体可分为可降解型与不可降解型，不可降解型如 Cytodex 系列微载体，扩增后需将所得细胞消化收获，该步骤常损失很大比例细胞。相比而言，可降解型如 CultiSpher 系列微载体，可不经消化收集细胞，直接用于组织工程移植，大大提高了细胞利用率。我们前期研究[11]发现，左旋聚乳酸（poly-L-lactic acid，PLLA）微载体在软骨细胞扩增以及维持软骨细胞表型方面均优于 CultiSpher G 微载体。然而，单独使用 PLLA 作为微载体材料细胞亲和力不够，细胞贴附不佳。故在此基础上，我们改进了微载体材料，将 PLLA 微载体被覆丝素蛋白（silk fibroin，SF）。脂肪来源干细胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）具有来源充足、易获取、有多向分化能力等优点，是组织工程非常有前景的一类 MSCs。本研究采用 SF-PLLA 微载体扩增 ADSCs，以期探索一种更加适合 ADSCs 增殖并用于软骨组织工程的可降解型微载体。
1 材料与方法
1.1 主要材料、试剂及仪器
人脂肪组织取自中国医学科学院整形外科医院行双下肢脂肪抽吸术的健康女性，样本获取均经患者知情同意。
L-DMEM 培养基、FBS、青/链霉素、胰蛋白酶-0.25%EDTA（GIBCO 公司，美国）；Ⅰ型胶原酶（Sigma 公司，美国）；成骨培养基、成软骨培养基、成脂培养基（Cyagen 公司，美国）；PicoGreenTM dsDNA 定量检测试剂盒、Live/DeadTM 细胞活力检测试剂盒（Thermo 公司，美国）；RNA 提取试剂盒（Qiagen 公司，德国）；逆转录试剂盒（北京全式金生物技术有限公司）；人 MSCs 流式检测试剂盒（BD 公司，美国）；CultiSpher G 微载体（Percell Biolytica 公司，瑞典）；SF-PLLA 微载体（中国医学科学院生物工程研究所）。
CO2 培养箱（Thermo 公司，美国）；旋转生物反应器（rotary cell culture system，RCCS；Synthecon 公司，美国）；倒置显微镜（Olympus 公司，日本）；共聚焦荧光显微镜（Leica 公司，德国）；流式细胞仪（BD 公司，美国）；LightCycler R 480Ⅱ实时荧光定量 PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，qRT-PCR）系统（Roche 公司，瑞士）。
1.2 ADSCs 分离、培养和鉴定
采用酶消化法获取 ADSCs。具体方法：取 10 mL 无菌脂肪组织，PBS 洗涤 2 遍，加入 0.2%Ⅰ型胶原酶，置于 37℃ 恒温摇床震荡消化 40 min，加入等体积完全培养基（含 10%FBS、1% 青/链霉素的 L-DMEM 培养基）终止消化后，300×g 离心 5 min，弃上清。沉淀用 PBS 重悬后，使用 70 μm 细胞筛过滤，滤液以 150×g 离心 5 min，弃上清。适量完全培养基重悬细胞沉淀，接种于 10 cm 培养皿，于 37℃、5%CO2 培养箱培养，每 2～3 天换液，待细胞融合 90% 后传代。
取第 3 代 ADSCs 行三系分化鉴定[12]，包括成骨诱导 21 d 行茜素红染色，成脂诱导 21 d 行油红 O 染色，细胞团成软骨诱导 21 d 行阿利新蓝染色；流式细胞仪检测细胞表面标志物（CD11b、CD19、CD34、CD45、CD73、CD90、CD105、HLA-DR）表达。经鉴定提示培养后所得细胞为 ADSCs。
1.3 微载体形状观察
取 SF-PLLA 与 CultiSpher G 微载体各 150 mg，用 PBS 浸泡过夜后，高压灭菌；将灭菌后的微载体采用完全培养基重悬预处理。取预处理后的微载体置于 24 孔板，采用倒置显微镜观察其颗粒外观。
1.4 微载体细胞培养及相关观测
1.4.1 微载体细胞接种与培养
各取 1 mL 第 3 代 ADSCs 悬液（细胞浓度为 2.5×106 个/mL）分别与 150 mg 预处理完毕的两种微载体充分混合，置于 50 mL 离心管中，加入完全培养基至 10 mL，于 37℃、5%CO2 培养箱中培养 4 h，每隔 30 min 轻微震荡混匀。接种完毕后取出细胞-微载体复合物置于 50 mL 旋转培养皿中，加满完全培养基；将旋转培养系统置于 37℃、5%CO2 培养箱中，静置过夜后，调整旋转培养系统以 10 r/min 速度开始转动，培养基每 2～3 天更换 1 次。实验重复 3 次。
1.4.2 扫描电镜观察
取接种前两种微载体以及动态培养 18 d 的细胞-微载体复合物，PBS 清洗 2 次，2.5% 戊二醛固定，梯度乙醇脱水处理后临界点干燥，真空喷溅铂金离子，扫描电镜观察 ADSCs 在两种微载体表面生长情况。
1.4.3 Live/Dead 染色观察
取动态培养 1、7、14、18 d 的两种细胞-微载体复合物，按照试剂盒说明书方法进行 Live/Dead 染色，室温避光孵育 40 min 后，采用荧光共聚焦显微镜观察细胞在微载体上分布及成活情况。
1.4.4 DNA 定量法检测细胞增殖
取动态培养 1、4、7、10、14、18 d 的两种细胞-微载体复合物，PBS 清洗 2 遍；加入 1 mL 0.5 mg/mL 蛋白激酶 K，56℃ 消化过夜；12 000×g 离心 10 min，取 100 μL 上清液加入 100 μL PicoGreen 工作液置入 96 孔板，每个样品重复 3 孔；避光孵育 5 min，使用酶标仪于 520 nm 波长处检测样本吸光度（A）值，通过绘制增殖曲线，将 A 值转化为细胞数量。
1.4.5 qRT-PCR 检测成软骨、成骨及成脂相关基因表达
实验分为 3 组：CultiSpher G 微球组（A 组）、SF-PLLA 微球组（B 组）与对照组（C 组）。其中 C 组为常规二维平面培养的 ADSCs，具体方法为：初始接种密度为 5 000 个/cm2，待细胞生长至 90% 后传代培养，传代接种密度与初始接种密度相同。分别取培养 18 d 的两种细胞-微载体复合物及二维平面培养至第 5 代的 ADSCs，按 RNA 提取试剂盒说明书提取样本 RNA，并按逆转录试剂盒方法，采用 1 000 ng 体系进行逆转录，将逆转录所得 cDNA 进行 qPCR，检测各组细胞成软骨、成骨及成脂相关基因表达。其中成软骨相关基因包括软骨特异性基因 SOX9、Ⅱ型胶原（collagen type Ⅱ，COL2）、软骨寡聚基质蛋白（cartilage oligomeric matrix protein，COMP）、蛋白聚糖（aggrecan，ACAN）、Ⅹ型胶原（collagen type Ⅹ，COL10）；成骨相关基因包括 runt 相关转录因子 2（runt-related transcription factor 2，RUNX2）、骨钙蛋白（osteocalcin，OCN）、骨粘连蛋白（osteonectin，ONN）；成脂相关基因包括过氧化物酶体增殖物激活受体 γ（peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPARγ）、脂蛋白酯酶（lipoprotein lipase，LPL）、脂联素基因（ADIPOQ）。各基因引物序列见表 1。目的基因表达水平使用同一样本 GAPDH 内参基因标准化，用 2−ΔΔCt 法计算各基因相对表达量。
表1
各基因引物序列
Table1.
Primer sequences of genes
1.4.6 扩增所得 ADSCs 鉴定
取各组培养 18 d 所得 ADSCs，采用流式细胞术检测细胞表面标志物 CD11b、CD19、CD34、CD45、CD73、CD90、CD105、HLA-DR 表达；并采用 1.2 方法进行三系分化鉴定。
1.5 统计学方法
采用 SPSS21.0 统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，两组间比较采用独立样本 t 检验；三组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用 SNK 检验；检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 微载体形状观察
倒置显微镜观察示，两种预处理后的微载体均大致呈球形，CultiSpher G 微载体直径为 130～380 μm，粒径相对不均一，内部空隙较小；SF-PLLA 微载体直径为 100～400 μm，粒径较 CultiSpher G 微载体均一，内部结构疏松，空隙较大。见图 1。
图1
两种微载体预处理后形状观察（倒置显微镜×100）a. CultiSpher G 微载体；b. SF-PLLA 微载体
Figure1.
Observation of the shape of two microcarriers after pretreatment (Inverted microscope×100)
a. CultiSpher G microcarriers; b. SF-PLLA microcarriers
2.2 微载体细胞培养与相关观测
2.2.1 扫描电镜观察
CultiSpher G 微载体表面粗糙，孔径不一，孔隙率较小；而 SF-PLLA 微载体孔隙率大，供细胞生长的空间更大。动态培养 18 d 时，两种微载体均保持结构形态稳定，SF-PLLA 微载体上细胞呈球状，细胞伸展程度以及细胞间相互连接不如 CultiSpher G 微载体。见图 2。
图2
扫描电镜观察（×200）
左为 CultiSpher G 微载体，右为 SF-PLLA 微载体 a. 接种细胞前；b. 接种细胞后动态培养 18 d
Figure2. Scanning electron microscope observation (×200)Left for CultiSpher G microcarriers, right for SF-PLLA microcarriersa. Pre-incubation; b. Dynamic culture for 18 days after ADSCs incubation
2.2.2 Live/Dead 染色观察
荧光共聚焦显微镜观察示，两种微载体接种细胞后，细胞可顺利黏附在微载体表面。动态培养 1 d，CultiSpher G 微载体上细胞数量多于 SF-PLLA 微载体。7 d，大量细胞增殖覆盖两种微载体表面，此时微载体之间尚无明显细胞及细胞外基质连接，且 CultiSpher G 微载体上细胞分布更加均匀，SF-PLLA 微载体上细胞成团分布。14 d，两种微载体表面被覆细胞均进一步增多，并出现微载体间融合、聚集现象，其中 Cultispher G 微载体间细胞连接结构较清晰、连接较多。18 d，细胞大量分泌细胞外基质，使得微载体紧密黏附在一起，形成团体。CultiSpher G 微载体上细胞形态舒展，呈多足状贴附于微载体表面，并与其他细胞间形成连接；而 SF-PLLA 微载体上细胞间连接相对较少，细胞更多呈现散在成团分布；此时两种微载体表面细胞分布均接近饱和。见图 3。
图3
动态培养各时间点 Live/Dead 染色观察（荧光共聚焦显微镜×100）
从左至右分别为动态培养 1、7、14、18 d a. CultiSpher G 微载体；b. SF-PLLA 微载体
Figure3. Live/Dead staining observation at each time point of dynamic culture (Confocal fluorescence microscope×100)From left to right for dynamic incubation for 1, 7, 14, and 18 days, respectively a. CultiSpher G microcarriers; b. SF-PLLA microcarriers
2.2.3 DNA 定量法检测细胞增殖
增殖曲线示，细胞接种于两种微载体后，细胞数量均呈逐渐增加趋势。其中细胞接种于 CultiSpher G 微载体后可迅速进入快速增殖期，而 SF-PLLA 微载体上细胞需经过一段时间适应后才能达到相同增殖速度。动态培养各时间点 CultiSpher G 微载体上细胞均多于 SF-PLLA 微载体，其中 4、7、10 d 时两种微载体上细胞数量比较差异有统计学意义（P<0.05）。10 d 时，两种微载体上细胞生长均开始减缓，18 d 时两种微载体上细胞数量差异无统计学意义（P>0.05），提示两种微载体高效扩增 ADSCs 的能力相当。见图 4。
图4
两种微载体上细胞增殖曲线
*与 SF-PLLA 微载体比较 P<0.05
Figure4. The cell proliferation curves on the two microcarriers*Compared with SF-PLLA microcarriers, P<0.052.2.4 qRT-PCR 检测
① 成软骨基因表达：培养 18 d，3 组均未检测到 COL2 及 COL10 基因表达。B 组早期成软骨转录因子 SOX9，COL2 上级调控因子 COMP 以及成软骨成熟标志物 ACAN 基因相对表达量均显著高于 A、C 组，差异有统计学意义（P<0.05）；A、C 组间 COMP 基因相对表达量比较差异有统计学意义（P<0.05），而 SOX9 和 ACAN 基因相对表达量比较差异均无统计学意义（P>0.05）。见图 5a～c。
图5
培养 18 d qRT-PCR 检测各组 ADSCs 三系分化相关基因相对表达量
*P<0.05 a. ACAN；b. SOX9；c. COMP；d. RUNX2；e. OCN；f. ONN；g. PPARγ；h. LPL；i. ADIPOQ
Figure5. The relative expression of differential-related genes in each group detected by qRT-PCR at 18 days after culture*P<0.05 a. ACAN; b. SOX9; c. COMP; d. RUNX2; e. OCN; f. ONN; g. PPARγ; h. LPL; i. ADIPOQ
② 成骨基因表达：A、B、C 组间成骨转录因子 RUNX2 基因相对表达量比较差异无统计学意义（P>0.05）。A、B 组细胞成骨早期标志物 ONN、成熟标志物 OCN 基因相对表达量均显著低于 C 组，差异有统计学意义（P<0.05）；B 组 OCN 基因相对表达量显著高于 A 组（P<0.05），而 ONN 基因相对表达量与 A 组比较差异无统计学意义（P>0.05）。见图 5d～f。
③ 成脂基因表达：A 组成脂转录因子 PPARγ、成脂早期标记物 LPL 及成熟脂肪标记物 ADIPOQ 基因相对表达量均显著高于 B、C 组，差异有统计学意义（P<0.05）；B 组 PPARγ、ADIPOQ 基因相对表达量显著低于 C 组（P<0.05），LPL 基因相对表达量与 C 组比较差异无统计学意义（P>0.05）。见图 5g～i。
2.2.5 扩增所得 ADSCs 鉴定
① 流式细胞术鉴定：B 组细胞 MSCs 阳性标记物 CD90、CD105 表达较 C 组降低，但仍表现出阳性结果；而 A 组各标志物表达量与 C 组相似。见图 6。A、B 组 MSCs 阴性标记物 CD11b、CD19、CD34、CD45、CD73、HLA-DR 与 C 组相比未见明显改变。② 三系诱导分化鉴定：3 组 ADSCs 成软骨、成骨、成脂诱导 21 d 后，阿利新蓝、茜素红及油红 O 染色均呈阳性，各组染色结果无明显差异。见图 7。
图6
培养 18 d 3 组扩增所得 ADSCs 流式细胞术鉴定
蓝色为同型对照，红色为样本；从上至下依次为 A、B、C 组 a. CD90；b. CD34、CD11b、CD19、CD45、HLA-DR；c. CD73；d. CD105
Figure6. Flow cytometric identification of ADSCs harvested from 3 groups after cultured for 18 daysBlue for isotype control, red for sample; from top to bottom for groups A, B, and C, respectively a. CD90; b. CD34, CD11b, CD19, CD45, HLA-DR; c. CD73; d. CD105
图7
3 组 ADSCs 成软骨、成骨、成脂诱导 21 d 后染色倒置显微镜观察
从左至右依次为 A、B、C 组 a. 阿利新蓝染色（×40）；b. 茜素红染色（×100）；c. 油红 O 染色（×100）
Figure7. ADSCs in 3 groups were observed by inverted microscope after 21 days of induction of chondrogenic, osteogenic, and adipogenic differentiationsFrom left to right for groups A, B, and C, respectively a. Alcian blue staining (×40); b. Alizarin red staining (×100); c. Oil red O staining (×100)
3 讨论
组织工程研究及应用需要大量种子细胞，大规模扩增 MSCs 并维持其干性对于组织工程的研究具有重要意义。作为细胞培养载体，微载体为细胞扩增提供了大量细胞贴附面积与充足的营养物质交换，是大规模扩增细胞的首选方案。其中，开发适合细胞生长、贴附的微载体，是目前研究重点。此前，我们报道了自制多孔 PLLA 微载体应用于软骨细胞扩增，发现该微载体虽在维持软骨细胞表型上优于 CultiSpher G 微载体，但细胞黏附性不佳，导致细胞利用率较低[11]。为了解决这一问题，我们选择蚕丝中提取的 SF 对 PLLA 微载体进行修饰，制成 SF-PLLA 微载体，以改进 PLLA 微载体的生物相容性、机械强度及降解速率。SF-PLLA 微载体直径为 100～400 μm，与 CultiSpher G 微载体相似，适合细胞贴附增殖，而且两者均能降解，是良好的组织工程研究材料。
本研究中，SF-PLLA 微载体可以很好地支持细胞附着和增殖。该微载体呈多孔结构、孔隙率较大，为细胞大量增殖提供了有效空间，也有利于营养物质的交换。动态培养 18 d 时，该微载体仍能保持稳定的形态结构，且细胞长入孔隙内部。材料降解方面，研究表明[13]CultiSpher G 微载体使用的明胶材料稳定性较差，蛋白酶即能将其分解；而 SF-PLLA 材料具有相对稳定的生物降解能力，体外降解时间约 1 年，能为细胞的大规模及长期培养提供更加稳定的支架环境。
细胞增殖实验探究了两种微载体扩增 ADSCs 的效率，结果显示动态培养 18 d 后，两种微载体上的细胞都得到了高效扩增。但在最初 10 d 内，CultiSpher G 微载体上细胞扩增效率高于 SF-PLLA 微载体，分析是 CultiSpher G 微载体为明胶材料，细胞黏附性强，可率先达到快速增殖的细胞密度；但后期随着 SF-PLLA 微载体上细胞逐渐适应环境后，两组细胞数量差距逐渐缩小。培养 18 d 时，两种微载体上 ADSCs 均实现大量增殖，两者细胞总量差异无统计学意义。
在验证了 ADSCs 可在两种微载体上高效扩增后，下一步实验对扩增所得细胞进行 qRT-PCR 分析，检测三系分化标志物相关基因表达情况，以确定其三系分化能力是否改变。迄今为止，尚无针对 MSCs 在 RCCS 微重力条件下培养收获后进行三系诱导分化能力分析的研究报道。本研究结果表明，SF-PLLA 微载体扩增的细胞 SOX9、COMP、ACAN 基因均上调，提示 SF-PLLA 微载体扩增所得 ADSCs 的成软骨能力增加，相较而言 CultiSpher G 微载体扩增细胞成软骨相关基因未见上调。这与微载体种类相关，丝素材料作为软骨组织工程良好的应用材料，其理化性能可能促使其负载的 ADSCs 向软骨方向分化。其他学者也观察到在丝素材料上培育 MSCs 向软骨方向分化的现象[14-15]，我们研究结论与之相似。此外，两组微载体上扩增所获细胞成骨相关基因表达未见明显上调，而成脂相关基因表达 SF-PLLA 组呈表达下调，CultiSpher G 组呈表达上调。然而，多项研究表明，经由搅拌式培养的 MSCs 成骨、成软骨能力增加，而成脂潜力被抑制[16-20]。我们的研究结果与微载体搅拌式生物反应器培养的 MSCs 研究结论不同，其原因尚不明确，可能是由于我们选用了 RCCS 系统，微重力条件下液体提供剪应力小于搅拌式培养，而高剪应力可通过影响连接细胞骨架的整合素，产生相应生物化学信号，改变细胞内的 Ca2+ 浓度，从而启动成骨、成软骨分化[21-23]。
最后，我们根据国际细胞治疗协会（ISCT）对 MSCs 鉴定的推荐标准[22]，对微载体上所获细胞进行了 MSCs 鉴定。其中流式细胞术分析结果显示，细胞表面标志物 CD90、CD105 均呈阳性，CD34、CD11b、CD19、CD45、CD73、HLA-DR 呈阴性，符合 MSCs 特征。三系分化诱导培养结果显示，阿利新蓝、茜素红、油红 O 染色均呈阳性，提示该细胞仍具有三系分化能力。综合流式细胞术分析及三系诱导分化结果，证实扩增所获细胞为 ADSCs。
综上述，SF-PLLA 微载体扩增 ADSCs 能力与 CultiSpher G 微载体相当，且成软骨分化能力上调，成脂能力下降，为后续软骨组织工程的支架材料探索提供了研究基础。但本研究仅针对 ADSCs 在 SF-PLLA 微载体上的扩增培养进行探索，未来需对其他来源 MSCs 进一步研究，以证明该类微载体在 MSCs 培养的普适性。此外，SF-PLLA 微载体孔径仍较小，使细胞进入微载体内部贴附生长受到阻碍，未来需对其结构进行改进。
作者贡献：黄元亮负责实验设计、实施及文章撰写；穆琳参与实验设计与实施；林燕娴参与实验设计与数据分析；滕利、蒋海越负责实验设计与评估，以及文章审阅。
利益冲突：所有作者声明，在课题研究和文章撰写过程中不存在利益冲突。基金项目经费支持没有影响文章观点和对研究数据客观结果的统计分析及其报道。
机构伦理问题：研究方案经中国医学科学院整形外科医院医学伦理委员会批准（2021-2）。
MSCs 具有多向分化潜能，在组织工程及再生医学中具有良好的应用前景[1-2]。但从人体直接获得的 MSCs 有限，为了达到使用需求，常需进行体外扩增[3-4]。传统细胞扩增通常借助于培养瓶或培养皿在二维平面条件下进行传代培养，该法培养基利用率低，并且需要重复传代及更换培养基等操作，增加了耗材、劳动成本与污染风险[5]。此外，该法无法模拟 MSCs 在生物机体内复杂的微环境，长期传代培养的 MSCs 表现出增殖能力下降，并逐渐失去多向分化潜能[6-8]。基于多孔微载体三维动态培养的 MSCs 扩增策略，是将细胞接种于微载体上，进行搅拌悬浮培养或模拟微重力系统培养，不仅更加贴近细胞在体内的微环境[9-10]，而且由于微载体提供了大量供细胞生长贴附的表面面积，从而使空间及培养基利用率更大，更适合大范围扩增细胞。
微载体可分为可降解型与不可降解型，不可降解型如 Cytodex 系列微载体，扩增后需将所得细胞消化收获，该步骤常损失很大比例细胞。相比而言，可降解型如 CultiSpher 系列微载体，可不经消化收集细胞，直接用于组织工程移植，大大提高了细胞利用率。我们前期研究[11]发现，左旋聚乳酸（poly-L-lactic acid，PLLA）微载体在软骨细胞扩增以及维持软骨细胞表型方面均优于 CultiSpher G 微载体。然而，单独使用 PLLA 作为微载体材料细胞亲和力不够，细胞贴附不佳。故在此基础上，我们改进了微载体材料，将 PLLA 微载体被覆丝素蛋白（silk fibroin，SF）。脂肪来源干细胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）具有来源充足、易获取、有多向分化能力等优点，是组织工程非常有前景的一类 MSCs。本研究采用 SF-PLLA 微载体扩增 ADSCs，以期探索一种更加适合 ADSCs 增殖并用于软骨组织工程的可降解型微载体。
1 材料与方法
1.1 主要材料、试剂及仪器
人脂肪组织取自中国医学科学院整形外科医院行双下肢脂肪抽吸术的健康女性，样本获取均经患者知情同意。
L-DMEM 培养基、FBS、青/链霉素、胰蛋白酶-0.25%EDTA（GIBCO 公司，美国）；Ⅰ型胶原酶（Sigma 公司，美国）；成骨培养基、成软骨培养基、成脂培养基（Cyagen 公司，美国）；PicoGreenTM dsDNA 定量检测试剂盒、Live/DeadTM 细胞活力检测试剂盒（Thermo 公司，美国）；RNA 提取试剂盒（Qiagen 公司，德国）；逆转录试剂盒（北京全式金生物技术有限公司）；人 MSCs 流式检测试剂盒（BD 公司，美国）；CultiSpher G 微载体（Percell Biolytica 公司，瑞典）；SF-PLLA 微载体（中国医学科学院生物工程研究所）。
CO2 培养箱（Thermo 公司，美国）；旋转生物反应器（rotary cell culture system，RCCS；Synthecon 公司，美国）；倒置显微镜（Olympus 公司，日本）；共聚焦荧光显微镜（Leica 公司，德国）；流式细胞仪（BD 公司，美国）；LightCycler R 480Ⅱ实时荧光定量 PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，qRT-PCR）系统（Roche 公司，瑞士）。
1.2 ADSCs 分离、培养和鉴定
采用酶消化法获取 ADSCs。具体方法：取 10 mL 无菌脂肪组织，PBS 洗涤 2 遍，加入 0.2%Ⅰ型胶原酶，置于 37℃ 恒温摇床震荡消化 40 min，加入等体积完全培养基（含 10%FBS、1% 青/链霉素的 L-DMEM 培养基）终止消化后，300×g 离心 5 min，弃上清。沉淀用 PBS 重悬后，使用 70 μm 细胞筛过滤，滤液以 150×g 离心 5 min，弃上清。适量完全培养基重悬细胞沉淀，接种于 10 cm 培养皿，于 37℃、5%CO2 培养箱培养，每 2～3 天换液，待细胞融合 90% 后传代。
取第 3 代 ADSCs 行三系分化鉴定[12]，包括成骨诱导 21 d 行茜素红染色，成脂诱导 21 d 行油红 O 染色，细胞团成软骨诱导 21 d 行阿利新蓝染色；流式细胞仪检测细胞表面标志物（CD11b、CD19、CD34、CD45、CD73、CD90、CD105、HLA-DR）表达。经鉴定提示培养后所得细胞为 ADSCs。
1.3 微载体形状观察
取 SF-PLLA 与 CultiSpher G 微载体各 150 mg，用 PBS 浸泡过夜后，高压灭菌；将灭菌后的微载体采用完全培养基重悬预处理。取预处理后的微载体置于 24 孔板，采用倒置显微镜观察其颗粒外观。
1.4 微载体细胞培养及相关观测
1.4.1 微载体细胞接种与培养
各取 1 mL 第 3 代 ADSCs 悬液（细胞浓度为 2.5×106 个/mL）分别与 150 mg 预处理完毕的两种微载体充分混合，置于 50 mL 离心管中，加入完全培养基至 10 mL，于 37℃、5%CO2 培养箱中培养 4 h，每隔 30 min 轻微震荡混匀。接种完毕后取出细胞-微载体复合物置于 50 mL 旋转培养皿中，加满完全培养基；将旋转培养系统置于 37℃、5%CO2 培养箱中，静置过夜后，调整旋转培养系统以 10 r/min 速度开始转动，培养基每 2～3 天更换 1 次。实验重复 3 次。
1.4.2 扫描电镜观察
取接种前两种微载体以及动态培养 18 d 的细胞-微载体复合物，PBS 清洗 2 次，2.5% 戊二醛固定，梯度乙醇脱水处理后临界点干燥，真空喷溅铂金离子，扫描电镜观察 ADSCs 在两种微载体表面生长情况。
1.4.3 Live/Dead 染色观察
取动态培养 1、7、14、18 d 的两种细胞-微载体复合物，按照试剂盒说明书方法进行 Live/Dead 染色，室温避光孵育 40 min 后，采用荧光共聚焦显微镜观察细胞在微载体上分布及成活情况。
1.4.4 DNA 定量法检测细胞增殖
取动态培养 1、4、7、10、14、18 d 的两种细胞-微载体复合物，PBS 清洗 2 遍；加入 1 mL 0.5 mg/mL 蛋白激酶 K，56℃ 消化过夜；12 000×g 离心 10 min，取 100 μL 上清液加入 100 μL PicoGreen 工作液置入 96 孔板，每个样品重复 3 孔；避光孵育 5 min，使用酶标仪于 520 nm 波长处检测样本吸光度（A）值，通过绘制增殖曲线，将 A 值转化为细胞数量。
1.4.5 qRT-PCR 检测成软骨、成骨及成脂相关基因表达
实验分为 3 组：CultiSpher G 微球组（A 组）、SF-PLLA 微球组（B 组）与对照组（C 组）。其中 C 组为常规二维平面培养的 ADSCs，具体方法为：初始接种密度为 5 000 个/cm2，待细胞生长至 90% 后传代培养，传代接种密度与初始接种密度相同。分别取培养 18 d 的两种细胞-微载体复合物及二维平面培养至第 5 代的 ADSCs，按 RNA 提取试剂盒说明书提取样本 RNA，并按逆转录试剂盒方法，采用 1 000 ng 体系进行逆转录，将逆转录所得 cDNA 进行 qPCR，检测各组细胞成软骨、成骨及成脂相关基因表达。其中成软骨相关基因包括软骨特异性基因 SOX9、Ⅱ型胶原（collagen type Ⅱ，COL2）、软骨寡聚基质蛋白（cartilage oligomeric matrix protein，COMP）、蛋白聚糖（aggrecan，ACAN）、Ⅹ型胶原（collagen type Ⅹ，COL10）；成骨相关基因包括 runt 相关转录因子 2（runt-related transcription factor 2，RUNX2）、骨钙蛋白（osteocalcin，OCN）、骨粘连蛋白（osteonectin，ONN）；成脂相关基因包括过氧化物酶体增殖物激活受体 γ（peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPARγ）、脂蛋白酯酶（lipoprotein lipase，LPL）、脂联素基因（ADIPOQ）。各基因引物序列见表 1。目的基因表达水平使用同一样本 GAPDH 内参基因标准化，用 2−ΔΔCt 法计算各基因相对表达量。
表1
各基因引物序列
Table1.
Primer sequences of genes
1.4.6 扩增所得 ADSCs 鉴定
取各组培养 18 d 所得 ADSCs，采用流式细胞术检测细胞表面标志物 CD11b、CD19、CD34、CD45、CD73、CD90、CD105、HLA-DR 表达；并采用 1.2 方法进行三系分化鉴定。
1.5 统计学方法
采用 SPSS21.0 统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，两组间比较采用独立样本 t 检验；三组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用 SNK 检验；检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 微载体形状观察
倒置显微镜观察示，两种预处理后的微载体均大致呈球形，CultiSpher G 微载体直径为 130～380 μm，粒径相对不均一，内部空隙较小；SF-PLLA 微载体直径为 100～400 μm，粒径较 CultiSpher G 微载体均一，内部结构疏松，空隙较大。见图 1。
图1
两种微载体预处理后形状观察（倒置显微镜×100）a. CultiSpher G 微载体；b. SF-PLLA 微载体
Figure1.
Observation of the shape of two microcarriers after pretreatment (Inverted microscope×100)
a. CultiSpher G microcarriers; b. SF-PLLA microcarriers
2.2 微载体细胞培养与相关观测
2.2.1 扫描电镜观察
CultiSpher G 微载体表面粗糙，孔径不一，孔隙率较小；而 SF-PLLA 微载体孔隙率大，供细胞生长的空间更大。动态培养 18 d 时，两种微载体均保持结构形态稳定，SF-PLLA 微载体上细胞呈球状，细胞伸展程度以及细胞间相互连接不如 CultiSpher G 微载体。见图 2。
图2
扫描电镜观察（×200）
左为 CultiSpher G 微载体，右为 SF-PLLA 微载体 a. 接种细胞前；b. 接种细胞后动态培养 18 d
Figure2. Scanning electron microscope observation (×200)Left for CultiSpher G microcarriers, right for SF-PLLA microcarriersa. Pre-incubation; b. Dynamic culture for 18 days after ADSCs incubation
2.2.2 Live/Dead 染色观察
荧光共聚焦显微镜观察示，两种微载体接种细胞后，细胞可顺利黏附在微载体表面。动态培养 1 d，CultiSpher G 微载体上细胞数量多于 SF-PLLA 微载体。7 d，大量细胞增殖覆盖两种微载体表面，此时微载体之间尚无明显细胞及细胞外基质连接，且 CultiSpher G 微载体上细胞分布更加均匀，SF-PLLA 微载体上细胞成团分布。14 d，两种微载体表面被覆细胞均进一步增多，并出现微载体间融合、聚集现象，其中 Cultispher G 微载体间细胞连接结构较清晰、连接较多。18 d，细胞大量分泌细胞外基质，使得微载体紧密黏附在一起，形成团体。CultiSpher G 微载体上细胞形态舒展，呈多足状贴附于微载体表面，并与其他细胞间形成连接；而 SF-PLLA 微载体上细胞间连接相对较少，细胞更多呈现散在成团分布；此时两种微载体表面细胞分布均接近饱和。见图 3。
图3
动态培养各时间点 Live/Dead 染色观察（荧光共聚焦显微镜×100）
从左至右分别为动态培养 1、7、14、18 d a. CultiSpher G 微载体；b. SF-PLLA 微载体
Figure3. Live/Dead staining observation at each time point of dynamic culture (Confocal fluorescence microscope×100)From left to right for dynamic incubation for 1, 7, 14, and 18 days, respectively a. CultiSpher G microcarriers; b. SF-PLLA microcarriers
2.2.3 DNA 定量法检测细胞增殖
增殖曲线示，细胞接种于两种微载体后，细胞数量均呈逐渐增加趋势。其中细胞接种于 CultiSpher G 微载体后可迅速进入快速增殖期，而 SF-PLLA 微载体上细胞需经过一段时间适应后才能达到相同增殖速度。动态培养各时间点 CultiSpher G 微载体上细胞均多于 SF-PLLA 微载体，其中 4、7、10 d 时两种微载体上细胞数量比较差异有统计学意义（P<0.05）。10 d 时，两种微载体上细胞生长均开始减缓，18 d 时两种微载体上细胞数量差异无统计学意义（P>0.05），提示两种微载体高效扩增 ADSCs 的能力相当。见图 4。
图4
两种微载体上细胞增殖曲线
*与 SF-PLLA 微载体比较 P<0.05
Figure4. The cell proliferation curves on the two microcarriers*Compared with SF-PLLA microcarriers, P<0.052.2.4 qRT-PCR 检测
① 成软骨基因表达：培养 18 d，3 组均未检测到 COL2 及 COL10 基因表达。B 组早期成软骨转录因子 SOX9，COL2 上级调控因子 COMP 以及成软骨成熟标志物 ACAN 基因相对表达量均显著高于 A、C 组，差异有统计学意义（P<0.05）；A、C 组间 COMP 基因相对表达量比较差异有统计学意义（P<0.05），而 SOX9 和 ACAN 基因相对表达量比较差异均无统计学意义（P>0.05）。见图 5a～c。
图5
培养 18 d qRT-PCR 检测各组 ADSCs 三系分化相关基因相对表达量
*P<0.05 a. ACAN；b. SOX9；c. COMP；d. RUNX2；e. OCN；f. ONN；g. PPARγ；h. LPL；i. ADIPOQ
Figure5. The relative expression of differential-related genes in each group detected by qRT-PCR at 18 days after culture*P<0.05 a. ACAN; b. SOX9; c. COMP; d. RUNX2; e. OCN; f. ONN; g. PPARγ; h. LPL; i. ADIPOQ
② 成骨基因表达：A、B、C 组间成骨转录因子 RUNX2 基因相对表达量比较差异无统计学意义（P>0.05）。A、B 组细胞成骨早期标志物 ONN、成熟标志物 OCN 基因相对表达量均显著低于 C 组，差异有统计学意义（P<0.05）；B 组 OCN 基因相对表达量显著高于 A 组（P<0.05），而 ONN 基因相对表达量与 A 组比较差异无统计学意义（P>0.05）。见图 5d～f。
③ 成脂基因表达：A 组成脂转录因子 PPARγ、成脂早期标记物 LPL 及成熟脂肪标记物 ADIPOQ 基因相对表达量均显著高于 B、C 组，差异有统计学意义（P<0.05）；B 组 PPARγ、ADIPOQ 基因相对表达量显著低于 C 组（P<0.05），LPL 基因相对表达量与 C 组比较差异无统计学意义（P>0.05）。见图 5g～i。
2.2.5 扩增所得 ADSCs 鉴定
① 流式细胞术鉴定：B 组细胞 MSCs 阳性标记物 CD90、CD105 表达较 C 组降低，但仍表现出阳性结果；而 A 组各标志物表达量与 C 组相似。见图 6。A、B 组 MSCs 阴性标记物 CD11b、CD19、CD34、CD45、CD73、HLA-DR 与 C 组相比未见明显改变。② 三系诱导分化鉴定：3 组 ADSCs 成软骨、成骨、成脂诱导 21 d 后，阿利新蓝、茜素红及油红 O 染色均呈阳性，各组染色结果无明显差异。见图 7。
图6
培养 18 d 3 组扩增所得 ADSCs 流式细胞术鉴定
蓝色为同型对照，红色为样本；从上至下依次为 A、B、C 组 a. CD90；b. CD34、CD11b、CD19、CD45、HLA-DR；c. CD73；d. CD105
Figure6. Flow cytometric identification of ADSCs harvested from 3 groups after cultured for 18 daysBlue for isotype control, red for sample; from top to bottom for groups A, B, and C, respectively a. CD90; b. CD34, CD11b, CD19, CD45, HLA-DR; c. CD73; d. CD105
图7
3 组 ADSCs 成软骨、成骨、成脂诱导 21 d 后染色倒置显微镜观察
从左至右依次为 A、B、C 组 a. 阿利新蓝染色（×40）；b. 茜素红染色（×100）；c. 油红 O 染色（×100）
Figure7. ADSCs in 3 groups were observed by inverted microscope after 21 days of induction of chondrogenic, osteogenic, and adipogenic differentiationsFrom left to right for groups A, B, and C, respectively a. Alcian blue staining (×40); b. Alizarin red staining (×100); c. Oil red O staining (×100)
3 讨论
组织工程研究及应用需要大量种子细胞，大规模扩增 MSCs 并维持其干性对于组织工程的研究具有重要意义。作为细胞培养载体，微载体为细胞扩增提供了大量细胞贴附面积与充足的营养物质交换，是大规模扩增细胞的首选方案。其中，开发适合细胞生长、贴附的微载体，是目前研究重点。此前，我们报道了自制多孔 PLLA 微载体应用于软骨细胞扩增，发现该微载体虽在维持软骨细胞表型上优于 CultiSpher G 微载体，但细胞黏附性不佳，导致细胞利用率较低[11]。为了解决这一问题，我们选择蚕丝中提取的 SF 对 PLLA 微载体进行修饰，制成 SF-PLLA 微载体，以改进 PLLA 微载体的生物相容性、机械强度及降解速率。SF-PLLA 微载体直径为 100～400 μm，与 CultiSpher G 微载体相似，适合细胞贴附增殖，而且两者均能降解，是良好的组织工程研究材料。
本研究中，SF-PLLA 微载体可以很好地支持细胞附着和增殖。该微载体呈多孔结构、孔隙率较大，为细胞大量增殖提供了有效空间，也有利于营养物质的交换。动态培养 18 d 时，该微载体仍能保持稳定的形态结构，且细胞长入孔隙内部。材料降解方面，研究表明[13]CultiSpher G 微载体使用的明胶材料稳定性较差，蛋白酶即能将其分解；而 SF-PLLA 材料具有相对稳定的生物降解能力，体外降解时间约 1 年，能为细胞的大规模及长期培养提供更加稳定的支架环境。
细胞增殖实验探究了两种微载体扩增 ADSCs 的效率，结果显示动态培养 18 d 后，两种微载体上的细胞都得到了高效扩增。但在最初 10 d 内，CultiSpher G 微载体上细胞扩增效率高于 SF-PLLA 微载体，分析是 CultiSpher G 微载体为明胶材料，细胞黏附性强，可率先达到快速增殖的细胞密度；但后期随着 SF-PLLA 微载体上细胞逐渐适应环境后，两组细胞数量差距逐渐缩小。培养 18 d 时，两种微载体上 ADSCs 均实现大量增殖，两者细胞总量差异无统计学意义。
在验证了 ADSCs 可在两种微载体上高效扩增后，下一步实验对扩增所得细胞进行 qRT-PCR 分析，检测三系分化标志物相关基因表达情况，以确定其三系分化能力是否改变。迄今为止，尚无针对 MSCs 在 RCCS 微重力条件下培养收获后进行三系诱导分化能力分析的研究报道。本研究结果表明，SF-PLLA 微载体扩增的细胞 SOX9、COMP、ACAN 基因均上调，提示 SF-PLLA 微载体扩增所得 ADSCs 的成软骨能力增加，相较而言 CultiSpher G 微载体扩增细胞成软骨相关基因未见上调。这与微载体种类相关，丝素材料作为软骨组织工程良好的应用材料，其理化性能可能促使其负载的 ADSCs 向软骨方向分化。其他学者也观察到在丝素材料上培育 MSCs 向软骨方向分化的现象[14-15]，我们研究结论与之相似。此外，两组微载体上扩增所获细胞成骨相关基因表达未见明显上调，而成脂相关基因表达 SF-PLLA 组呈表达下调，CultiSpher G 组呈表达上调。然而，多项研究表明，经由搅拌式培养的 MSCs 成骨、成软骨能力增加，而成脂潜力被抑制[16-20]。我们的研究结果与微载体搅拌式生物反应器培养的 MSCs 研究结论不同，其原因尚不明确，可能是由于我们选用了 RCCS 系统，微重力条件下液体提供剪应力小于搅拌式培养，而高剪应力可通过影响连接细胞骨架的整合素，产生相应生物化学信号，改变细胞内的 Ca2+ 浓度，从而启动成骨、成软骨分化[21-23]。
最后，我们根据国际细胞治疗协会（ISCT）对 MSCs 鉴定的推荐标准[22]，对微载体上所获细胞进行了 MSCs 鉴定。其中流式细胞术分析结果显示，细胞表面标志物 CD90、CD105 均呈阳性，CD34、CD11b、CD19、CD45、CD73、HLA-DR 呈阴性，符合 MSCs 特征。三系分化诱导培养结果显示，阿利新蓝、茜素红、油红 O 染色均呈阳性，提示该细胞仍具有三系分化能力。综合流式细胞术分析及三系诱导分化结果，证实扩增所获细胞为 ADSCs。
综上述，SF-PLLA 微载体扩增 ADSCs 能力与 CultiSpher G 微载体相当，且成软骨分化能力上调，成脂能力下降，为后续软骨组织工程的支架材料探索提供了研究基础。但本研究仅针对 ADSCs 在 SF-PLLA 微载体上的扩增培养进行探索，未来需对其他来源 MSCs 进一步研究，以证明该类微载体在 MSCs 培养的普适性。此外，SF-PLLA 微载体孔径仍较小，使细胞进入微载体内部贴附生长受到阻碍，未来需对其结构进行改进。
作者贡献：黄元亮负责实验设计、实施及文章撰写；穆琳参与实验设计与实施；林燕娴参与实验设计与数据分析；滕利、蒋海越负责实验设计与评估，以及文章审阅。
利益冲突：所有作者声明，在课题研究和文章撰写过程中不存在利益冲突。基金项目经费支持没有影响文章观点和对研究数据客观结果的统计分析及其报道。
机构伦理问题：研究方案经中国医学科学院整形外科医院医学伦理委员会批准（2021-2）。
