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找到 作者 包含"吴朝阳" 11条结果
  • BMP-2基因重组慢病毒载体转染猪BMSCs成骨分化研究

    目的构建 BMP-2基因重组慢病毒载体,并检测其转染猪BMSCs 后BMP-2表达活性及诱导BMSCs成骨分化情况,为进一步构建组织工程骨软骨奠定基础。 方法取2只2月龄巴马香猪(体重约15 kg)髂骨骨髓,采用密度梯度离心法分离培养BMSCs,并传代。利用基因重组技术构建 BMP-2基因重组慢病毒载体,并以感染复数(multiplicity of infection,MOI)10、25、50、100、200转染第2代BMSCs,通过荧光显微镜及倒置相差显微镜观察确定最佳MOI值。以最佳 MOI 值感染 BMSCs作为实验组,空载体转染的 BMSCs(空载体组)及未转染的 BMSCs(空白组)作为对照,通过 RT-PCR、免疫组织化学染色、Western blot检测 BMP-2 mRNA及蛋白在 BMSCs 中的表达,并应用ALP染色、ALP活性检测及茜素红钙结节染色检测其成骨分化情况。 结果经RT-PCR基因测序鉴定 BMP-2基因重组慢病毒载体构建成功,转染 BMSCs后荧光显微镜下可见绿色荧光表达,且MOI值为 100 时为最佳表达。RT-PCR 提示 BMP-2 基因成功转染至 BMSCs 中;免疫组织化学染色及 Western blot检测示转染后BMSCs并可持续、稳定、高效表达 BMP-2蛋白;培养后2周BMSCs可见ALP表达及钙结节形成。 结论成功构建 BMP-2基因重组慢病毒载体并转染猪 BMSCs,BMP-2 基因转染入 BMSCs 后能持续、稳定、高效表达 BMP-2 基因和蛋白,并成功诱导 BMSCs 向成骨细胞分 化。

    发表时间:2016-08-31 04:05 导出 下载 收藏 扫码
  • 猪TGF-β1 基因重组慢病毒载体的构建及其在BMSCs 中的表达

    目的 构建猪TGF-β1 重组慢病毒表达载体,并转染BMSCs,为构建组织工程骨软骨提供TGF-β1 修饰的BMSCs,作为持续、高效的种子细胞。 方法 将已获取的目的基因TGF-β1 cDNA 包装至慢病毒载体中,通过PCR及基因测序对阳性克隆进行鉴定,并测定病毒滴度。取2 月龄巴马香猪(体重约15 kg)骨髓制备BMSCs,取第2 ~ 3代用于实验。用TGF-β1 重组慢病毒载体以感染复数(multiplicity of infection, MOI)为10、50、70、100、150 分别转染BMSCs,通过激光共聚焦显微镜观察,并以Western blot 检测不同MOI 值的转染效果,确定最佳MOI 值。用TGF-β1 重组慢病毒载体以最佳MOI 值感染BMSCs 作为实验组,以空载体转染的BMSCs(空载体组)及未转染的BMSCs(空白组)作为对照,通过RT-PCR、免疫细胞化学染色、ELISA 等方法检测TGF-β1 基因及蛋白在BMSCs 中的表达情况,并检测Ⅱ型胶原表达情况。 结果 经PCR 及基因测序鉴定TGF-β1 重组慢病毒表达载体构建成功,并成功转染BMSCs,激光共聚焦显微镜下可观察到强绿色荧光;Western blot 示MOI 为70 时转染效果最佳;RT-PCR 示实验组TGF-β1 基因的表达量明显高于空载体组及空白组,差异有统计学意义(P lt; 0.05);免疫细胞化学染色示实验组TGF-β1 蛋白及Ⅱ型胶原呈阳性表达,而空载体组及空白组呈弱阳性或阴性表达;ELISA 示实验组TGF-β1 蛋白至转染后21 d 仍有较高表达。 结论 TGF-β1 重组慢病毒表达载体可成功转染BMSCs,TGF-β1 蛋白可长期、稳定表达,促使BMSCs 向成软骨细胞方向分化。

    发表时间:2016-08-31 04:23 导出 下载 收藏 扫码
  • 改良经皮椎体后凸成形术在胸腰椎转移癌诊断和治疗中的应用

    目的 探讨改良经皮椎体后凸成形术(percutaneous kyphoplasty,PKP)对无法耐受开放手术及麻醉的胸腰椎转移癌患者的诊断和治疗价值。 方法 2009 年9 月- 2010 年9 月,采用改良PKP 治疗无法耐受开放手术及麻醉的胸腰椎转移癌16 例。男7 例,女9 例;年龄60 ~ 73 岁,平均64.5 岁。病程3 ~ 6 个月,平均4 个月。均为胸腰椎转移癌。腰背疼痛采用视觉模拟评分(VAS)为(8.9 ± 0.8)分,均无脊髓及神经根受压表现。受累椎体:T7 1 例,T8 1 例,T121 例,L2 2 例,L3 2 例,L4 3 例,T1、2 1 例,T3、4 1 例,T7、8 1 例,T11、12 1 例,T7 ~ L1 1 例,T12 ~ L4 1 例。椎体后壁均完整,椎体压缩性骨折9 例,椎体压缩程度均lt; 75%。 结果 患者均顺利完成手术,无严重心、肺、脑血管不良反应和围手术期内死亡。病理检查均确诊为转移性腺癌。患者均获随访,随访时间9 ~ 18 个月,平均14 个月。术后6 个月疼痛按WHO 标准分度,14 例(87.5%)完全缓解,2 例部分缓解。术后6 个月VAS 评分降至(1.8 ± 0.6)分,与术前比较差异有统计学意义(P lt; 0.05)。术后6 个月CT 检查示,2 例3 个椎体存在不同程度骨水泥渗漏。随访期间12 例死亡,其余带瘤生存,腰背疼痛症状明显缓解。 结论 对于无法耐受开放手术及麻醉的胸腰椎转移癌患者,采用改良PKP 进行诊断和治疗具有创伤小、活检准确率高,疼痛缓解迅速,且能提高患者生存质量,是一种良好的姑息治疗方法。

    发表时间:2016-08-31 05:42 导出 下载 收藏 扫码
  • 人脑源性神经营养因子基因修饰BMSCs 经静脉移植对大鼠损伤脊髓结构和功能影响的初步研究

    目的 探讨采用增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)为报告基因的人脑源性神经营养因子(human brain-derived neurotrophic factor,hBDNF)基因修饰的大鼠BMSCs 经静脉移植后,在大鼠损伤脊髓内存活和基因表达情况,及对损伤脊髓的修复效果。 方法 健康成年雄性SD 大鼠96 只,体重(250 ± 20)g。取第3 代SD 大鼠BMSCs,以感染复数为100 转染重组腺病毒载体Ad5-hBDNF-EGFP 及Ad5-EGFP,制备密度为1 × 106 个 /mL的hBDNF-EGFP-BMSCs 和空载体-EGFP-BMSCs 单细胞悬液。随机分为4 组,hBDNF-EGFP-BMSCs 静脉移植组(A 组)、空载体-EGFP-BMSCs 静脉移植组(B 组)、损伤对照组(C 组)和假手术组(D 组),每组24 只。A、B、C 组采用改良Allen重物打击法制作T10 节段脊髓损伤模型;D 组大鼠同法暴露T10 节段脊髓,但不造成脊髓冲击损伤。模型建立3 d 后,A、B、C 组分别经尾静脉注射hBDNF-EGFP-BMSCs 单细胞悬液、空载体-EGFP-BMSCs 及0.1 mol/ L PBS 各1 mL,D 组不予注射。各组大鼠于脊髓损伤后24 h 及静脉移植后1、3、5 周分别行大鼠后肢运动功能BBB 评分、皮层体感诱发电位(cortical somatosensory evoked potential,CSEP)检测、荧光倒置相差显微镜观察、Western blot 法检测、免疫组织化学染色观察及透射电镜观察。 结果 静脉移植后,A 组恢复最快,3、5 周时BBB 评分高于B、C 组(P lt; 0.05)。A、B、C 组于静脉移植5 周时可检测到CSEP,A 组潜伏期缩短及峰峰值增加较B、C 组明显(P lt; 0.05)。各时间点A、B 组大鼠脊髓损伤节段均可观察到绿色荧光,C、D 组各时间点均未检测到绿色荧光。静脉移植后1、3、5 周,A 组均检测出hBDNF 蛋白表达,其他各组均未检测出hBDNF 蛋白表达。A、B、C 组神经丝蛋白200(neurofilament 200,NF-200)及突触素Ⅰ表达均随着静脉移植时间延长逐渐增强,至5 周时各组表达达高峰,其中A 组表达最强(P lt; 0.05);各时间点A、B、C 组NF-200 表达均强于D 组,而各时间点A、B、C 组突触素Ⅰ表达均弱于D 组,差异有统计学意义(P lt; 0.05)。术后5 周透射电镜观察示,A组损伤区脊髓结构较完整、清晰,B、C 组见胶原增生及轴索萎缩。 结论 hBDNF 基因修饰的大鼠BMSCs 经静脉移植后可向损伤脊髓聚集并存活,表达hBDNF 蛋白,促进神经结构修复及功能重建。

    发表时间:2016-08-31 05:48 导出 下载 收藏 扫码
  • 大鼠软骨细胞复制性老化的体外观察

    目的 对体外培养大鼠软骨细胞复制性老化行为进行观察,为进一步研究组织工程软骨退变机制,以及用药物干预并逆转其退变提供实验参考。方法 4周龄SD大鼠,体重185~200 g,断颈处死,分离培养软骨细胞,采用组织化学法检测传代培养的P1、P2、P3及P4代软骨细胞老化相关β-半乳糖苷酶,透射电镜观察细胞结构,免疫细胞化学法检测增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)表达,阿力新蓝染色检测胞外基质硫酸糖胺多糖 (sulfat-glycosaminoglycan,GAG)含量和分子结构,RT-PCR方法检测软骨细胞Ⅱ型胶原表达,流式细胞仪分析细胞周期及增殖指数(proliferative index,PI)。结果 β-半乳糖苷酶检测:P1、P2代软骨细胞偶见阳性染色;P3代可见少数细胞阳性染色,与P1、P2代比较差异有统计学意义(P<0.01);P4代与P1~P3代比较,阳性染色显著增加,差异有统计学意义(P<0.01) 。透射电静镜观察:P1、P2代细胞胞浆内细胞器较多,胞核及核仁清晰,无凋亡软骨细胞;P3代细胞核浆比较大,胞浆内细胞器减少,胶原网络结构模糊不清;P4代细胞核浆比例增大,核固缩。P4代细胞G0/G1期含量增加(83.8%),而P1、P2及P3代分别为79.1%,79.2%,80.8%。P4代细胞PI为16.2%,P1、P2、P3代PI分别为20.9%、20.8%、19.2%。PCNA表达、GAG含量、长链分子百分比、Ⅱ型胶原表达减少等指标P4代与前代比较差异均有统计学意义(Plt;0.01)。结论 体外培养的大鼠软骨细胞P4代出现老化。

    发表时间:2016-09-01 09:20 导出 下载 收藏 扫码
  • 鹿茸多肽对软骨表型化骨髓间充质干细胞凋亡的影响

    目的 通过观察鹿茸多肽对白细胞介素 1β(interleukin 1β,IL-1β)诱导软骨表型化骨髓间充质干细胞(marrow mesenchymal stem cells,MSCs)凋亡的影响,以优化软骨组织工程的种子细胞。方法 新西兰大白兔2只,抽取其骨髓;经密度梯度离心得到单核细胞,经体外分离、培养获得兔MSCs。用转化生长因子β1(transforming growth factor β1,TGF-β1)和碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)将其诱导分化软骨表型。将软骨表型化MSCs随机分成A组(空白对照组):5%胎牛血清的αMEM培养液;B组(IL-1β组):5%胎牛血清的αMEM培养液加入100 ng IL-1β;C组(鹿茸多肽组):5%胎牛血清的αMEM培养液加入10 μg/ml鹿茸多肽作用3d后再加入100 ng IL-1β;D组(TGF-β1组):5%胎牛血清的α-MEM培养液加10 ng/ml TGF-β1作用3 d后再加入100 ng IL-1β。分别于培养24、48和72 h后取样,采用透射电镜观察细胞形态,Annexin V法检测细胞凋亡率,RT-PCR技术分析Caspase-3 mRNA表达水平,ELISA法检测Caspase-3蛋白酶活性。结果 透射电镜观察:B组24 h后细胞核内染色质开始呈块状凝集,分布于核膜下,核膜不规则;48 h后细胞核内染色质凝集加剧;72 h后部分细胞内的核碎片凝集成凋亡小体。各时间点C、D组细胞结构改变相对滞后,且数量较少;A组细胞结构几乎无明显改变。各时间点B组MSCs凋亡率、Caspase-3 mRNA表达及蛋白酶活性逐渐增高,与A组比较差异有统计学意义(Plt;0.01);C、D组与B组比较则逐渐下降,且差异有统计学意义(Plt;0.05)。结论 Caspase3参与MSCs凋亡,鹿茸多肽通过减少Caspase-3 mRNA表达,并抑制其蛋白酶活性,阻止或逆转软骨表型化MSCs凋亡。

    发表时间:2016-09-01 09:25 导出 下载 收藏 扫码
  • 异体软骨细胞复合Pluronic修复关节软骨缺损

    目的 探讨运用同种异体软骨细胞复合 Pluronic修复关节软骨缺损的可行性 ,并应用 3H- Td R放射自显影方法鉴别软骨缺损修复的细胞来源。方法 取同种异体软骨细胞体外培养至第 2代 ,用 3H- Td R标记后复合Pluronic植入兔关节软骨缺损区作为实验组 ,并采用单纯Pluronic植入作为材料对照组 ,不作任何处理组为空白对照组 ,分别于 4、8及 16周取材 ,观察其修复效果 ,并应用放射自显影方法鉴别修复组织的细胞来源。结果 实验组术后 8周 ,缺损表面可见新生软骨形成 ,术后 16周缺损完全修复 ,表面光滑 ,与周围界限模糊 ,放射自显影证实所修复组织的细胞来源于植入细胞。材料对照组及空白对照组缺损均未见明显修复。结论 1同种异体软骨细胞复合 Pluronic修复关节软骨缺损是可行的 ;2 3H- Td R标记细胞可作为鉴别细胞来源的一种简便可行的方法。

    发表时间:2016-09-01 09:35 导出 下载 收藏 扫码
  • 胶原-壳聚糖/胶原-纳米羟基磷灰石仿生支架材料的制备及其生物相容性检测

    目的制备胶原-壳聚糖/胶原-纳米羟基磷灰石(collagen-chitosan/nano-hydroxyapatite-collagen-polylactic acid,Col-CS/nHAC-PLA)仿生支架材料,检测生物相容性,为其在骨软骨缺损修复中的应用奠定基础。 方 法以1,4二氧六环为溶剂,按8%质量浓度加入PLA和等量nHAC溶解,制备nHAC-PLA;用2%醋酸溶液配制浓度为2%的CS纯溶液及1%的Col纯溶液,以质量比(M/M)20∶1混合,倒入含nHAC-PLA的模具中,冷冻干燥成形制备Col-CS/nHAC-PLA仿生支架。行急性全身毒性实验、皮内刺激实验、热源实验、溶血实验、体外细胞毒实验、骨植入实验,评价其生物相容性。 结果Col-CS/nHAC-PLA仿生支架无急性全身毒性;皮内刺激实验示原发刺激指数为0分,为极轻微刺激;热原实验示3只实验动物体温升高均lt; 0.6℃,体温升高总和lt; 1.3℃,符合规定标准;溶血实验示平均溶血率为1.38%,符合 ≤5%标准。体外细胞毒性实验示材料浸提液不影响兔BMSCs增殖,毒性分级为Ⅰ级。骨植入实验显示支架材料与周边组织相容性好。 结论Col-CS/nHAC-PLA仿生支架材料具有良好生物相容性,有望成为较理想的组织工程骨软骨支架。

    发表时间:2016-08-31 04:24 导出 下载 收藏 扫码
  • 尿液特征组分与糖尿病早期肾损害的关系初探

    目的 对尿液特征组分与糖尿病早期肾损害的关系进行了初步探索。 方法 对2011年12月-2012年5月间28例2型糖尿病组、33例2型糖尿病肾病组及26例健康对照组尿液中尿蛋白含量和几种常见非蛋白氮物质,包括肌酸、尿囊素、肌酐、尿酸和假尿嘧啶核苷的浓度进行测定,采用多种归一化方法对数据进行对比分析,并通过t检验减少高效液相色谱测定的变量信息,保留P<0.05的检出峰进行主成分分析,获得分类结果。 结果 采用体积归一化方法,发现健康对照组尿液中肌酸、尿囊素和尿酸的含量与2型糖尿病组和糖尿病肾病组相比,差异均有统计学意义(P<0.05),2型糖尿病组尿液中尿蛋白的浓度与糖尿病肾病组相比,差异有统计学意义(P<0.05)。 结论 通过肌酸、尿囊素、尿酸和尿蛋白的联合测定为肾脏损伤程度的监测及疗效观察提供依据,为2型糖尿病患者肾功能损坏的早期预防与诊断进行初步判断提供了新的方法。

    发表时间:2016-09-08 09:12 导出 下载 收藏 扫码
  • 非胆源性重症急性胰腺炎的治疗方式选择

    目的探讨非胆源性重症急性胰腺炎的治疗方式选择。方法回顾性分析2004~2010年期间我科收治的175例非胆源性重症急性胰腺炎患者的临床资料,其中157例非手术治疗,18例在非手术治疗的基础上,外科微创手术干预治疗。结果157例非手术治疗,治愈150例(95.2%),死亡7例(4.8%),死亡原因为多器官功能衰竭; 手术干预18例,治愈13例(72.2%),死亡5例(27.8%),其中3例全身感染合并胰腺坏死,2例十二指肠瘘、胰瘘、腹腔内反复出血。结论非胆源性重症急性胰腺炎以非手术综合治疗措施为基础治疗,非手术治疗无效具备手术指征时,应综合患者情况适时进行外科微创手术干预。

    发表时间:2016-09-08 10:42 导出 下载 收藏 扫码
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